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1、思考题* 生物药物的特点？P7答：1组成结构复杂，具有严格的空间构像，以维持其特定的生理功能。2要测定分子量（组分相同的、分子质量不同、活性不同）3要测定生物活性（和药效相关）4要效价测定（除含量测定，要效价测定或酶活力测定表明有效成分含量）5要确定结构（如氨基酸序列分析）* 生物制品的质量检定包括哪些方面？P14答：1理化测定 2.安全检定 3效力检定 * 生物药物常用的定量方法有哪些？P17答： 1 酶法 2 电泳法 3 理化测定 4 生物检定法* 什么是电泳？如何对其分类，分别有哪些？P94答：电泳是指带电粒子在电场力的作用下与自身所带相反的电荷方向移动分类。按支持物可分为：纸电泳，醋酸
2、纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳。 按凝胶形状可分为：水平平板电泳，圆盘柱状电泳，垂直平板电泳。* 影响电泳迁移率的因素包括？P95答：1，带电粒子的性质，电子带静电荷越多，越接近球形，电泳速度快2，电场强度，越强速度越快 3 溶液的ph值 ，对于蛋白质来说，当ph接近等电点，速度越快，4溶液离子强度，离子强度越小，速度越快 5电渗作用* 血清蛋白常用什么电泳技术分离？核酸常用什么电泳技术分离？P99答：血清蛋白：常用醋酸纤维素薄膜电泳； 核酸：琼脂糖电泳* 为什么聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用最广泛的凝胶电泳技术？P100答：1聚丙烯酰胺聚合物分子解离基因量很少，故
3、电渗作用小，对样品吸附作用小，容易制备，并可在吸收2 机械性较好，孔隙可以调节凝胶比重实现可调，具有可拉性分析筛效应3，一定范围对热稳定，无色透明，容易观察，4丙烯酰胺较纯，可精制，污染小 5聚丙烯酰胺凝胶在280nm 没有吸收 利于样品蛋白质电泳后的扫描检测。* SDS-PAGE电泳用于测定？其中SDS的作用是什么？P102答：sds主要是用来测定蛋白质的分子量，其中sds作用有两个：1，消除不同蛋白表面表面电荷效应，2引起蛋白构象改变，消除蛋白质的结构效应.* 核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决于哪三个因素？P98答：琼脂糖浓度，核酸分子的大小，核酸的形状* DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时
4、，有什么效应与什么效应？答：分子筛效应和电荷效应* 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括连续系统和不连续电泳，其定义和区别分别是什么？答：1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。2.不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。区别：不连续系统能使稀样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分离条带清晰度以及分辨率。* 什么是分子筛效应？答：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，
5、阻力大，移动慢。什么是等电点？什么是等电聚焦？答：在某一ph的溶液中，当两性例子的正负电荷值相等，该ph值为等电点。等电聚焦：在电泳槽中放入载体的两性点解质形成一个由阳极到阴极增加的ph梯度，当蛋白质放进此体系时，不同蛋白质即移动到或者聚焦于与其等电点相当的ph值的位置上。* 在生物大分子的高效液相色谱分离分析中，哪些是常用的分离模式？各分离模式的原理和应用对象是什么？答：常用的分离模式为：吸附色谱，分配色谱，离子交换色谱，体积排阻色谱，亲和色谱吸附色谱：机理：依靠分离物质和流动相分子竞争固定相的活性位置，从而使溶质洗脱下来对象：几何异构体，磷脂，甾体，脂溶性维生素，前列腺素分配色谱：机理：利
6、用被分离物质在两相的分配系数不同而使组分分离对象：氨基酸，多肽分析，蛋白质分离，碱基核酸和核酸酶，糖类离子交换色谱：机理：组分离子与树脂上的可交换例子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂的亲和不同而达到分离。对象：例子或者可离解的化合物，如氨基酸，多肽核酸，核苷和碱基体积排阻色谱：机理：组分通过体积排阻色谱中的固定相（多孔隙凝胶），产生分子筛效应来实现分离。对象：高聚物，蛋白质亲和色谱：机理：样品中各种物质与固定相载体配基之间亲和作用的差别而实现 分离对象：酶，酶抑制剂，抗体，抗原，受体* 简述亲和色谱的分离机理。答：机理：1样品中各种物质与固定相载体配基之间亲和作用的差别而实现分离，2，过程
7、是待测物质和配机间的亲和复合物形成及其解离的过程，对于非转移性的吸附的杂质，可用缓冲液洗去。* 什么是生物检定法？答：生物检定法：利用药物对生物（整体和离体）的作用，来测定其生物活性的一种定量方法。应用范围：药物效价的测定，药物毒性成分和有害物质的限度检查，新药的研发氨基酸、蛋白质* 氨基酸最常用的鉴别方法是什么？答：氨基酸的茚三酮检测法，现象：显蓝紫色* 蛋白质多用什么提取？答：水溶液提取（稀盐溶液提取，5c以下，碘乙酸防水解），有机溶液提取（乙醇，丙酮，丁醇提取脂类蛋白），表面活性剂提取（非离子型表面活性剂）* 蛋白质的纯化方法有哪些？答：1. 沉淀法（peg，有机溶剂，盐析，等电点，热处
8、理）2. 色谱法（离子交换，亲和，疏水，体积排阻）3. 电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦）4. 离心法5. 膜分离法（透析）6. 双水相系统萃取法* 什么是盐溶？什么是盐析?答：盐溶：蛋白质在第离子强度的介质中表现为溶解，盐析：蛋白质在高离子强度介质中表现为盐析。常用盐为硫酸铵，原因：高盐吸水，夺取水相* 常用于蛋白质沉淀的方法有哪些？答：盐析法、PEG沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、热处理沉淀法* 色谱法纯化蛋白质常用哪些类型？分别根据什么原理进行分离？答：排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、经典的吸附色谱等。原理上述有写* 什么是密度梯度离心？答：密度梯度离心：一种在连续
9、或者不连续的密度梯度介质中，将物质进行离心的方法。（装载密度梯度介质，梯度介质有足够大的溶解度，常用介质：蔗糖密度梯度系统，制备：梯度混合器，层层铺垫，介质的最大密度比沉降样品的最小密度小。，适用于大小有别而密度相似的样品）* 什么是透析？主要用途是什么？答：透析：样品装入由半透膜制成的透析袋，透析膜允许容积小分子的溶质通过，而大分子则载留在袋内。用途：透析的主要用途是从生物大分子样品中除去盐类或其它小分子物质。 透析法也可以用来除去与生物大分子结合较弱的小分子或离子，如金属离子及酶的辅助因子NAD，FAD等* 蛋白质的定量方法有哪些？答：1光谱法（紫外吸收光谱法）2化学法（凯氏定氮法测有机物
10、含氮量经典方法，双缩脲法，福林酚法，染料结合方法 ）* 什么是凯氏定氮法？试分析出现奶粉事件的原因以及改进办法？答：凯氏定氮法：测定化合物或者混合物中的总氮量的一种方法（方法：消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） ，蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使H+ ），滴定用已标定的无机酸滴（使H+ 恢复），计算总氮量）。奶粉事件的原因：有毒奶粉中主要是过多添加了三聚氰胺，而奶粉中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以常用凯氏定氮法的方法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更多的氮原子
11、，所以在一些事件中被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象。改进方法：三聚氰胺HPLC-UV检测方法：三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果* 蛋白质的纯度如何鉴定？答：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），等电聚焦，毛细管电泳，HPLC* 蛋白质的分子量测定有哪些方法？分别有什么特点？答：SDS-PAGE，凝胶过滤，毛细管电泳，质谱法特点：sds-page：
12、误差小，重现性好，紫外可测，一次实验可以获得多种定量数据。凝胶过滤：可测定水溶性高聚物的平均分子量毛细管电泳：高速，高效，高分辨率质谱：质量范围宽，简单操作，快速定量，灵敏，误差小* 什么是双相电泳技术？p295答：双相电泳技术：等电聚焦+sds-page，应用于蛋白质分子的两个特性对其进行分析分离，第一相：根据不同蛋白质分子所带电荷差异，用等电聚焦，第二相：根据蛋白质分子量的大小，用sds-page。核酸* 核酸在酸溶液和碱溶液中分别发生什么变化？答：核酸在酸性条件下：发生水解，生成碱基，核糖或者脱氧核糖和磷酸， 核酸在碱性条件下：dna双链解螺旋，dna发生变性。* 如何判断核酸样品纯度？
13、答：通过分光光度计，用a250/a280比值进行核酸的纯度测定，（ 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链寡核苷酸的含量为30g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。）糖* 糖类的一般鉴别方法是什么（定性）？答：1，酸水解 2，molish反应 3，含有半缩醛结构的糖类的酒石酸铜鉴定 4，测定旋光度* 举出两种多糖的分子量测定方法。答：1，比色法 2，高效液相色谱法* 掌握多糖的提取步骤答：水提醇沉* 常用于多糖纯度的鉴定方法有哪些？答：page ， 琼脂糖，紫外 ，hplc* 如何用紫外分光光度法检验多糖提取后的纯度？答：酸水解，产物在288nm处有最大吸收，制作标准曲线，求得含量，测得纯度。* 植物提取多糖的含量测定常用什么方法？答：比色法，紫外，hplc，gc，生物测定法* 了解多糖的结构分析（糖苷键连接位置的测定）答：1，光谱用于连接方式的测定：红外和核磁共振2，位置的测定：1高碘酸法（1.2羟基 123羟基测定）smith降解，甲基化反应产物分析，乙酰解后的质谱分析