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1、实验一 酶促反应与时间的关系初速度时间范围测定 原理酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。它能专一性水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即测定单
2、位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1mol产物所需的酶量。图 酶反应进程曲线要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间
3、范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。试剂和器材 1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min离心30min，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。（2）酸性磷酸酯酶液取原酶液，用0.05mol/L pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度
4、A405在0.60.7之间。（3）1.2 mmol/L对-硝基苯磷酸酯（NPP）精确称取NPP 0.4454g，加缓冲液定容至1000 mL。（4）0.3 mol/L NaOH。2、器材：（1）恒温水浴槽（2）可见光分光光度计（3）试管、刻度吸管方法和步骤取试管12支，按下表编号，0号为空白。各管加入1.0mL 1.2 mmol/L NPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7 mL，在酶反应前底物与酶都放入35恒温水浴槽中预热2分钟。然后向111号管内各加入1.0 mL 预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3、5、7、10、12、15、20、25、30、40、50分钟进行反应。待反应进
5、行到上述各相应时间时，加入3.0 mL 0.3 mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白，在分光光度计上测定各管A405值。管号试剂12345678910110*对硝基苯磷酸酯（NPP）（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0稀释酶液（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0反应时间（min）3571012152025304050250.3 mol/L NaOH（mL）3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0 * 0号管加入1.0mL NPP后保温25分钟，然后加入3 mL
6、0.3 mol/L NaOH，再加入1.0 mL酶液。数据处理以反应时间为横坐标，A405为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。实验二 pH对酶活力的影响最适pH的测定原理pH对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH即酶的最适pH，因为通常各种酶只在一定pH范围内才表现它的活力；一种酶在不同pH条件下所表现出来的活性不同。pH之所以对酶活性有很大影响，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物的结合；而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团解离状态不利于酶与底物的结合，酶活力也相应降低。p
7、H也可影响底物的解离及反应系统中其它组分的解离。缓冲系统的离子性质和离子强度，也可能对酶反应产生影响。另外，pH除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有很大影响。过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。本实验测定pH对酸性磷酸酯酶活性的影响并测定最适pH。 试剂和器材 1、试剂（1） 酸性磷酸酯酶原酶液 （2）酸性磷酸酯酶酶液：原酶液用水稀释10倍左右，使pH-酶活力曲线中第六管O.D405在0.6-0.7之间。 （3）2.4mmol/L NPP水溶液精确称取NPP 0.8908克，用水溶解并定容至1000毫升。 （4）0.3mol/L NaOH （5
8、）各pH缓冲液 a0.05 mol/L柠檬酸溶液 b0.05 mol/L柠檬酸三钠溶液 按下表配制，并以测得数据为准。0.05 mol/L柠檬酸（ml）100 82 71 59 47 35 23 11.5 4.0 1.00.05 mol/L柠檬酸三钠（ml） 0 18 29 41 53 65 77 88.5 96 99pH2.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 0 方法和步骤取11支试管自行编号制表，0号为空白。相应加入2.4mmol/L NPP 0.2 mL，不同pH缓冲液各1.8 mL，每管再各加入35 预保温（另取2支试管，各加入稀释好的酶液5-6 mL，
9、都在35 恒温水浴槽中保温2分钟）的酶液1 mL，即刻摇匀计时，15分钟后加入0.3mol/L NaOH 2.0 mL终止反应。0号管先加NaOH后加酶液。冷却后测O.D405。数据处理以反应pH为横坐标，O.D405为纵坐标，绘制pH-酶活力曲线，求出酸性磷酸单酯酶在本实验条件下的最适pH。实验三 温度对酶活力的影响最适温度的测定 原理温度对酶的影响具有双重作用。一方面，温度加速酶反应的速度；另一方面酶是蛋白质，温度升高会加速酶蛋白的变性。因此，在较低温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大；超过一定温度后，反应速度下降。酶反应速度达到最大值时的温度称酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定
10、，而在一系列变化的温度下测酶活力；以温度为横坐标，反应速度为纵坐标作图，可得到一条温度-酶活力曲线，从中可求得最适温度。各种酶的最适温度是不同的，一般动物组织的各种酶的最适温度在3540，植物和微生物的各种酶的最适温度范围较大，大约在3260之间。但最适温度不是酶的特征常数，一种酶的最适温度不是一个恒定数值，它与反应条件有关。如反应时间延长，一般最适温度降低。因此，对同一种酶来讲，应说明是在什么条件下的最适温度。温度是影响酶促反应速度的重要因素之一。在温度较低时，绝对温度对Vmax的影响遵守Arrnenius公式程式：式中 Ea酶促反应的活化能（Jmol1）；R气体常数（8.314Jmol1K
11、1 ）；T绝对温度（K）；Vmax当酶全部被过量底物饱和时所测得的反应速度。实验时，测定不同温度下的酶促最大反应速度Vmax，以log10Vmax对绝对温度T作图，得一斜率等于-Ea/ 2.3R的直线，由此可求得活化能Ea。试剂和器材1、试剂 （1）酸性磷酸酯酶原酶液 （2）酸性磷酸酯酶酶液：原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五管O.D405，在0.60.7之间。 （3）1.2 mmol/L NPP（用缓冲液配制） （4）0.3 mol/L NaOH2、器材 （1）恒温水浴槽 （2）可见光分光光度计 （3）试管 （4）刻度吸管方法和步骤取8支试管，自行编号制表，0
12、号为空白。各管加入1.2 mmol/L NPP 1.0 mL，另取8支试管加入酶液2 mL。酶与底物对应在10，20，30，35，40，50，60，70恒温水浴槽保温2min。酶液预热时间不要超过2min，否则酶易失活，特别是在温度较高时。各管加入酶液1.0 mL，精确反应15min后，加入0.3 mol/L NaOH 3.0 mL终止反应。0号管反应温度为50，先加入0.3 mol/L NaOH 3.0 mL后加酶。冷却后以0号管为空白，测定O.D405。数据处理1、以反应温度为横坐标，A680(代表反应速度)为纵坐标，绘制温度酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶在本实验条件下的最适温度。2、以反应
13、绝对温度的倒数（1/T）为横坐标，log10 A405为纵坐标作图，求出直线部分的斜率，计算酶促反应的活化能。实验四 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定原理 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。底物浓度SVmax反应速度V图 底物浓度对反应速度的影响底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示： 式中 v反应速度；Km米氏常数；Vmax酶反应最
14、大速度；S 底物浓度。从米氏方程式可见：米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。测定Km、Vmax，一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/S作图，可得到一条直线(见图)。直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出K
15、m与Vmax。图 双倒数作图法抑制剂影响酶促反应的因素之一，根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可逆抑制有可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。 （1）竞争性抑制类型：酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表观米氏常数Km增加，Vm不变。（下式中Ki为抑制剂常数，I为抑制剂浓度）。 （2）非竞争性抑制类型：抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，Km不变，Vm下降。 （3）反竞争性抑制类型：抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。Km、Vm 都发生变化。 对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/
16、v1/S作图法，求出Km、Ki、 Vm，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。图 各抑制剂双倒数图试剂和器材1、试剂试剂和器材1、试剂（1） 酸性磷酸酯酶原酶液（2）0.05mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0）（3）酸性磷酸酯酶酶液：原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五管O.D405，在0.60.7之间。 （4）1.2 mmol/L NPP（用缓冲液配制） （5）0.3 mol/L NaOH （6）10mmol/L KH2PO4（7）3m mol/L NaF2、器材： （1）恒温水浴槽（2）可见光分光光度计（3）试管、刻度吸管方法和步骤取20支试管按下表
17、编号。15号为各不相同底物浓度的样品的空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加NaOH，后加酶液。其余各按下表操作。以15管中相应的底物浓度作空白，在可见光分光光度计上测O.D405。表一： 试管号试剂（mL）12345678910空白无抑制剂1.2 mmol/L NPP0.20.40.60.81.00.20.40.60.81.010mmol/L KH2PO4-3m mol/L NaF-0.05mol/L柠檬酸缓冲液1.81.61.41.21.01.81.61.41.21.0稀释酶液35保温2min1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.035精确反应15min0.3 m
18、ol/L NaOH2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0 表二： 管号试剂（mL）12345678910KH2PO4NaF1.2 mmol/L NPP0.20.40.60.81.00.20.40.60.81.010mmol/L KH2PO40.30.30.30.30.3-3m mol/L NaF-0.30.30.30.30.30.05mol/L柠檬酸缓冲液1.51.31.10.90.71.51.31.10.90.7稀释酶液35保温2min1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.035精确反应15min0.3 mol/L NaOH2.02.02.02.02
19、.02.02.02.02.02.0数据处理通过测定，得到一组数据O.D405，由于酶反应产物对-硝基盐离子在0.1-0.2 mol/L NaOH中，在405nm出的摩尔消光系数为18.8103，则O.D405与反应速度的换算为： O.D405 106 测定液体积（mL）v（mol/L对-硝基酚/分）= t 18.8103 1000式中，O.D405为每管测定液，t为反应时间（分）。反应液中底物浓度换算式： X M S = 3式中，X为底物加入的ml数；3为反应液体积；M为加入时底物浓度（mmol/L）。通过计算求得S，、v、1/s、1/v、I等值，然后作双倒数图，三条曲线作在同一曲线上，求出Km、Vm、Ki及抑制类型。