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1、 JP本法利用鲎试剂（从鲎Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus血细胞提取物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。检测时，可用其中任一种方法进行试验。当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以凝胶法测定结果为准。试验操作过程应防止内毒素的污染。仪器所
2、有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250。若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。内毒素储备标准溶液的制备以BET检查用水溶解内毒素10000对照标准品或内毒素100对照标准品，制取细菌内毒素试验（BET）的内毒素储备标准溶液。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。1EU相当于1个内毒素国际单位（1U）。内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用水稀释，即得BET检查用内毒素标准溶液。得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。供试品溶液
3、的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释药品来制备供试品溶液。药用容器内盛放的供试品溶液的制备方法见其他具体规程。如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选鲎试剂的使用pH范围内。一般要求供试品溶液的pH值范围为6.08.0。试液或调节pH值用溶液应用BET检查用水配制，在去除内毒素的容器中贮存。确定最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。MVD按下列公式确定：MVD = 内毒素限值供试品溶液浓度/内毒素限值：根据剂量，注射剂的内毒素限度即为K/M的值，其中K为人每公斤体重可接受的内毒素中热原的最小量（EU
4、/kg），M指人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。供试品溶液的浓度表示法：当内毒素限度以质量（EU/mg）表示时，用mg/mL表示浓度。当内毒素限度以（EU/mEq）表示时，用mEq/mL表示浓度。当内毒素限度以生物单位（EU/Unit）表示时，用Units/mL表示浓度。当内毒素限度以体积（EU/mL）表示时，用mL/mL表示浓度。：指凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/mL)，或为浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低点（EU/mL)的对应值。凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素的方法。为确保试验结果精确、有效，应根据预备试验中的说明开展试验，复核鲎试剂的标
5、示灵敏度和试验的干扰因素。（1） 预备试验（i） 鲎试剂的标示灵敏度复核试验在规定的条件下，使所用鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为该鲎试剂的标示灵敏度。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。按照下述步骤开展试验。用BET检查用水稀释内毒素储备标准溶液，制成2、0.5和0.25四种浓度的标准溶液。用BET检查用水或适当的缓冲液溶解鲎试剂，得到鲎试液。在每支试管中，分别混合等体积（通常为0.1mL)的鲎试液和标准溶液。如使用的是装有鲎试剂冻干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。装有反应试剂混合物的试管（或西林瓶或安瓿之类的容器）通常
6、在371下保存602分钟，在此过程中，要避免试管的振荡。保温结束后，为测试凝胶的完整性，缓缓将每个容器倒转1800。如果形成了坚实的凝胶，倒转后凝胶不移位，此时将该项检查的结果记录为阳性。如未能形成凝胶，或形成的凝胶不坚实、在倒转过程中出现了滑脱，该项检查的结果即为阴性。试验时，每一个浓度的标准溶液平行做4管。仅在每组试验中的0.25标准溶液的检查结果为阴性的情况下，试验方为有效。如试验无效，确认试验条件后，重复该试验。反应终点浓度指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。使用下面的公式，计算终点浓度的几何平均值：终点浓度的几何平均值lg-1(e/f)e所用系列溶液的终点浓度的对数值的
7、和f平行管的数量当终点浓度的几何平均值在0.5至2.0之间，可判定受试鲎试剂的标示灵敏度为。（ii） 干扰因素试验开展该项实验的目的是检查供试品溶液中反应的增强因素或阻抑因素的存在。按表1制备溶液A、B、C、D。其中A、B为供试品溶液，C、D以BET检查用水制取。A、B、C、D构成一组试验，再依样配制一组溶液以供平行试验用。孵育温度、孵育时间和形成凝胶的确认方法见（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。根据（1）预备试验下的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项中列出的公式，计算B和C溶液的终点浓度的几何平均值。如试验条件发生了任何可能影响到试验结果的变化，须重新进行干扰因素试验。表1
8、溶液内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释剂稀释倍数稀释后内毒素的浓度平行管数A0/供试品溶液4B2/供试品溶液供试品溶液1248210.50.254C2/BET检查用水BET检查用水1248210.50.252D0/BET检查用水2只有当溶液A和D中无反应、且溶液C的结果在复核的鲎试剂灵敏度范围内时，试验方有效。如果溶液B的终点浓度的几何平均值在0.5，2.0间，可判定供试品溶液在该浓度下无干扰作用；反之则判定供试品溶液对试验能形成干扰。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。可通过对供试品溶液或进行更大倍数的稀释或通过其他适宜
9、的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。（2） 限度试验按鲎试剂标示灵敏度复核试验项下有关形成含内毒素的坚实凝胶的说明进行操作，该法可检查供试品溶液的内毒素含量是否超出了内毒素限度。（i） 方法按表2制备溶液A、B、C、D。以该四种溶液为一组试验的供试品，每组试验做两组平行。根据（1）预备试验项下的（ii）干扰因素试验的说明制取溶液A和B。孵育温度、孵育时间和形成凝胶的确认方法见（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。表2溶液内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A0/供试品溶液2B2/供试品溶液2C2/BET检查用水2D0/BET检查用水2（ii） 结果判断只有溶液B和C
10、的平行管的试验结果均为阳性、溶液D的平行管的试验结果均为阴性时，试验方有效。溶液A的平行管的试验结果均为阴性时，可判定供试品符合试验的内毒素限度要求。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。以MVD稀释的溶液A的两个平行管均为阳性时，供试品不符合内毒素限度要求。若供试品溶液再小于MVD的稀释倍数下得到的试验结果为阳性，应将供试品溶液以MVD倍数进行稀释，再次开展试验。（3） 定量试验通过将凝胶滴定至反应终点，测量供试品的内毒素终点浓度。（i） 方法按表3制备溶液A、B、C、D。以该四种溶液为一组试验的
11、供试品，每组试验做两组平行。根据（1）预备试验项下的（ii）干扰因素试验的说明制取溶液A和B。孵育温度、孵育时间和形成凝胶的确认方法见（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。表3溶液内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释剂稀释倍数*稀释后内毒素的浓度平行管数A0/供试品溶液BET检查用水1248-2222B2/供试品溶液1210.50.252C2/BET检查用水BET检查用水12482D0/BET检查用水2* 可适当调整溶液A的稀释倍数，但不得超过MVD。（ii） 计算和结果判断符合下列三个条件时，可将试验判为有效：（a）阴性对照溶液D的两组平行管均显阴性，（b）供试品阳性对照溶液B的两
12、个平行管均显阳性，（c）溶液C的终点浓度的几何平均值在0.52之间。反应终点指溶液A的系列稀释液中最后一管呈阳性。计算溶液A的内毒素浓度时，应将内毒素浓度记为终点稀释倍数乘以。用（1）预备试验项下的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项下的公式计算两组平行实验的内毒素浓度的几何平均值。如溶液A的稀释液均显阴性，应记为内毒素浓度小于乘以溶液A的最小稀释倍数。如溶液A的所有稀释液均呈阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以。根据溶液A的内毒素浓度的平均值计算供试品的内毒素浓度（单位为EU/mL、EU/mg、mEq、EU/unit）。光度测定法（1） 浊度法本法利用检测鲎试液凝胶的浊度变化来测
13、定供试品中内毒素的浓度。这种方法又可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法系依据在指定的反应时间内，反应混合物的浊度与内毒素浓度之间的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的浊度（或检测浊度增加速度）与内毒素浓度之间的量化关系来测定内毒素的含量的方法。光度测定试验的温度通常为371；浊度亦可用吸光度表示。（2） 显色法该法系利用检测鲎试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。这种方法又可分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法
14、。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。显色试验的温度通常为371。（3） 预备试验为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。（i）标准曲线的可靠性试验每批鲎试剂都必须通过标准曲线的可靠性试验。用内毒素标准溶液，制成至少三个浓度的稀释液，以获取符合所用鲎试剂说明书上描述的内毒素浓度范围的标准曲线。在鲎试剂的最佳使用条件下（体积比、孵育时间、温度、pH等）开展试验，每一内毒素标准浓度至少做三支平行管。如预期范围超过2个对数（two logs），为使标准曲线反映出每个对数增长
15、（log increase），应相应增加标准品溶液。就设定的内毒素浓度范围而言，相关系数的绝对值r必须大于等于0.980。如试验无效，确认试验条件之后，重新开展实验。如试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，必须再次开展标准曲线的可靠性试验。（iii） 干扰因素试验按表4制备溶液A、B、C、D。在鲎试剂的最佳测试条件（供试品和鲎试液体积、供试品于鲎试液的体积比、孵育时间等）下，对这些溶液开展试验。如发生了任何可能影响检验结果的条件变化，必须重新开展干扰因素试验。表4溶液内毒素浓度配制内毒素的溶液平行管或微孔数A0供试品溶液*1不少于2个B标准曲线的中点*2供试品溶液*1不少于2个C至少3
16、个浓度*3BET检查用水每一浓度不少于2个D0BET检查用水不少于2个*1 供试品溶液的稀释倍数不得超过MVD。*2 加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的供试品溶液。*3 为“（3）预备试验下（i）标准曲线的可靠性试验”项下描述的标准内毒素溶液的浓度。只有在符合下列两种情况时，试验方有效。1 溶液C得到的标准曲线的相关系数的绝对值大于或等于0.980。2 溶液D的试验结果不得大于所用鲎试剂的说明书中规定的空白值的限度，或必须小于所用鲎试剂的内毒素检测限。用溶液B的内毒素含量减去溶液A中内毒素的含量，计算溶液B的内毒素的回收率。当溶液B的内毒素的回收率在50200之间时，可认为在此
17、试验条件下供试品溶液中不存在干扰因素。当内毒素的回收率不在指定范围内，则判定在此试验条件下供试品溶液中存在干扰因素。如果供试品不符合该试验的要求，应将供试品进一步稀释，但稀释倍数不得超过MVD，再重复进行试验。对供试品溶液或供试品的稀释液进行适当处理（如过滤、中和、透析、加热处理等）可排除干扰。（4） 含量分析（i） 方法按表4制备溶液A、B、C、D，试验步骤同“（3）预备试验下的（ii）干扰因素试验”项下的说明。（ii） 内毒素浓度的计算用溶液C的标准曲线计算溶液A的内毒素浓度。试验必须符合以下三个条件方有效。1. 溶液C的标准曲线的相关系数的绝对值大于或等于0.980。2. 用溶液B中的内
18、毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的回收率要在50200的范围内。3. 溶液D的试验结果不得大于所用鲎试剂的说明书中规定的空白值的限度，或必须小于所用鲎试剂的内毒素检测限。（iii） 结果判断若由溶液A的内毒素浓度计算得到的供试品内毒素含量符合具体专论中的内毒素限度（单位为EU/mL、EU/mg、mEq、EU/unit）的要求，可判断供试品符合细菌内毒素检查的要求。EP本法利用鲎试剂（从鲎Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus血细胞提取物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂
19、与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。这一章阐述了下面6种方法：方法A：凝胶法：限度试验方法B：凝胶法：半定量试验方法C：动态浊度试验方法D：动态显色法方法E：终点显色法方法F：终点浊度法检测时，可用6种方法的任一种进行试验。当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。试验操作过程应防止内毒素的污染。仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250。若使用塑
20、料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。内毒素以国际单位（IU）表示。IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BE
21、T检查用内毒素标准溶液。得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。某些成分或药品可能在其它的水溶液中溶解度更高。如有必要，调节待测溶液（或它的稀释液）的pH值，使鲎试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选鲎试剂生产商的指定pH范围内。一般要求供试品溶液的pH值范围为6.08.0。可用鲎试剂生产商推荐的酸、碱或适当的缓冲溶液来调解pH值。酸或碱溶液须用BET检查用水在去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。确定最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品
22、溶液的最大稀释倍数。MVD按下列公式确定：MVD = 内毒素限值供试品溶液浓度/内毒素限值：在剂量的基础上，注射药物的活性成分的内毒素限度为K/MK=人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量（EU/kg）M人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。专论中，注射剂的活性成分的内毒素限度的单位有IU/ml、IU/mg、IU/生物活性单位等。供试品溶液的浓度表示法：当内毒素限度以质量（IU/mg）表示时，用mg/ml表示浓度。-当内毒素限度以（IU/ml）表示时，用ml/ml表示浓度。-当内毒素限度以生物单位（IU/Unit）表示时，用Units/ml表示浓度。=指凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，或指浊度法
23、或显色法使用的标准回归曲线上最低点（IU/ml)的对应值。凝胶法（方法A和B）凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量内毒素的方法。在标准条件下，可引起鲎试液凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。为确保试验结果精确、有效，应根据预备试验中的说明开展试验，复核鲎试剂的标示灵敏度和试验的干扰因素。（1） 预备试验（i） 鲎试剂的标示灵敏度复核试验灵敏度用IU/ml表示。应在鲎试剂用于检查内毒素之前对灵敏度进行复核；复核试验需要制备标示灵敏度的4支平行管。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。用BET检查用水稀释内毒素储
24、备标准溶液，制成2、0.5和0.25四种浓度的标准溶液。在每支试管中，分别混合等体积（通常为0.1mL)的鲎试液和标准溶液。如使用的是装有鲎试剂冻干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。按照鲎试剂生产商的建议，将反应混合物孵育一段时间(通常在371下保存602分钟)，在此过程中，不能震动试管。凝胶的完整性测试：如使用试管作为容器，先将试管从保温箱中取出，再缓缓将试管倒转1800。如果形成了坚实的凝胶，倒转后凝胶不移位，此时将该项检查的结果记录为阳性。如未能形成坚实且不变形的凝胶，该项检查的结果即为阴性。仅在最低浓度的标准溶液的所有平行管的检查结果均为阴性的情况下，试验方为有效。反应终点浓度
25、指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。将终点浓度取对数，计算它们的平均值，再将平均值的结果取反对数，最后的表达式如下：终点浓度的几何平均值lg-1(e/f)e所用系列溶液的终点浓度的对数值的和f平行管的数量反应终点的浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测量值（IU/ml）。当终点浓度的几何平均值在0.5至2.0之间时，可判定受试鲎试剂的标示灵敏度为，可用于内毒素的检查。（ii） 干扰因素试验开展该项实验的目的是检查供试品溶液中反应的增强因素或阻抑因素的存在。按表2.6.14.-1制备溶液A、B、C、D。供试品的稀释度不得超过MVD，且供试品溶液不能检查出内毒素，具体操作见（1）预备试
26、验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。表2.6.14-1溶液内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释剂稀释倍数稀释后内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液4B2/供试品溶液供试品溶液1248210.50.254444C2/BET检查用水BET检查用水1248210.50.252222D0/BET检查用水2A=经检查无内毒素的溶液B=干扰实验用C=鲎试剂标示灵敏度的对照品D=阴性对照品（BET检查用水）根据（1）预备试验下的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项中列出的公式，计算B和C溶液的终点浓度的几何平均值。如试验条件发生了任何可能影响到试验结果的变化，须重新进行干扰因素试验。只有当溶液A和D的所有平行
27、管中无反应、且溶液C的结果在复核的鲎试剂灵敏度范围内时，试验方有效。经测定，如果溶液B的灵敏度在0.5，2.0间，可判定供试品溶液在该实验条件下，对实验无干扰；反之则判定供试品溶液对试验能形成干扰。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。使用灵敏度更高的鲎试剂进行内毒素的检查时，因为灵敏度更高的鲎试剂能排除实验的干扰因素，供试品的稀释倍数也可适当放宽。可通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进
28、行干扰实验。（2） 限度试验（方法A）按鲎试剂标示灵敏度复核试验项下有关形成含内毒素的坚实凝胶的说明进行操作，该法可检查供试品溶液的内毒素含量是否超出了内毒素限度。（i） 方法按表2.6.14-2制备溶液A、B、C、D。实验方法见（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。表2.6.14-2溶液内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A0/供试品溶液2B2/供试品溶液2C2/BET检查用水2D0/BET检查用水2制备溶液A、B（供试品阳性对照），稀释倍数不得超过MVD。按照（1）预备实验，（ii）干扰因素实验项下的说明开展实验。溶液B、C（阳性对照）所含标准内毒素的浓度为鲎试剂标示灵敏度的
29、两倍。溶液D（阴性对照）为BET检查用水。（ii） 结果判断只有溶液B和C的平行管的试验结果均为阳性、溶液D的平行管的试验结果均为阴性时，试验方有效。溶液A的平行管的试验结果均为阴性时，可判定供试品符合试验的内毒素限度要求。如溶液的平行管的检查结果均为阳性时：- 如供试品的稀释倍数为MVD，供试品不符合规定。- 如供试品的稀释倍数小于MVD，应将供试品溶液稀释至较大但不超过MVD的倍数，再次开展实验。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。（3） 半定量试验（方法B）（i） 方法通过将供试品滴定至反应
30、终点，对供试品所含的细菌内毒素定量。按表2.6.14-3制备溶液A、B、C、D。以该四种溶液为一组试验的供试品，每组试验做两组平行。具体实验操作见（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。表2.6.14-3溶液内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释剂稀释倍数稀释后内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液BET检查用水1248-2222B2/供试品溶液1210.50.252C2/BET检查用水BET检查用水12482D无/BET检查用水2溶液A=不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始，用BET检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。溶液
31、B=2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）溶液C=含有2、0.5和0.25浓度标准内毒素的BET检查用水系列。溶液D=BET检查用水（阴性对照）（ii） 计算和结果判断符合下列三个条件时，可将试验判为有效：（a）溶液D（阴性对照）的两组平行管均显阴性，（b）溶液B（供试品阳性对照）的两个平行管均显阳性，（c）溶液C的终点浓度的几何平均值在0.52之间。测定溶液A的内毒素浓度，计算溶液A的系列稀释液的终点浓度时，应将内毒素浓度记为终点稀释倍数乘以。供试品的内毒素浓度指这些平行管的反应终点浓度的几何平均值（见（1）预备试验项下的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项下的公式）。如实验使用的是供试品
32、的稀释液，计算时，将检查结果乘以稀释倍数，即得到原始溶液的内毒素浓度。如在有效的实验中，供试品的检查结果均显阴性，应记为内毒素浓度小于（如实验使用的是供试品的稀释液，检查结果应记为内毒素浓度小于乘以供试品的最小稀释倍数）。如供试品的所有结果均为阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以（如，在表2.6.14-3中，初始稀释因子8）。如内毒素的浓度小于其专论中的规定浓度，可判定供试品符合检查要求。光度测定法（方法C、D、E和F）（1） 浊度法本法利用检测鲎试液凝胶的浊度变化来测定供试品中内毒素的浓度。根据检测原理，这种方法又可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法（方法F）系依据在孵育终
33、止时，反应混合物的浊度（吸光度或透光率）与内毒素浓度之间的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法（方法C）是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的浊度到达某一预先设定的吸光度需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。根据鲎试剂生产商的建议，光度测定试验应在孵育温度下进行（通常为371）。（2） 显色法（方法D和E）该法系利用检测鲎试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。根据检测原理，这种方法又可分为终点显色法和动态显色法。终点显色法（方法E）是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法（方
34、法D）是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。根据鲎试剂生产商的建议，光度测定试验应在孵育温度下进行（通常为371）。（3） 预备试验为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。当实验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需要验证试验方法。（i） 标准曲线的可靠性试验用内毒素标准溶液制成至少三个浓度的稀释液，以获取标准曲线。按照鲎试剂生产商的建议（体积比、孵育时间、温度、pH等），每一内毒素标准浓度的溶液至少做三支平行管。使用动态法检测时，如预期范围超过2 log，为使标准曲线反映
35、出每个对数增长（log increase），应相应增加标准品溶液。在鲎试剂生产商规定的内毒素浓度范围内，相关系数的绝对值r必须大于等于0.980。（ii） 干扰因素试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表2.6.14-4制备溶液A、B、C、D。在鲎试剂生产商的建议测试条件（供试品和鲎试液体积、供试品于鲎试液的体积比、孵育时间等）下，对这些溶液开展试验，每种溶液至少做两组平行。表2.6.14-4溶液内毒素浓度配制内毒素的溶液平行管或微孔数A无供试品溶液不少于2个B标准曲线的中点供试品溶液不少于2个C至少3个浓度（最低浓度规定为）BET检查用水每一浓度不少于2个D0BET检查用水不少于
36、2个溶液A=稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。溶液B=加入了标准曲线终点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的、且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。溶液C=如“3.预备实验（i）标准曲线的可靠性试验”项下描述的、用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。溶液D=BET检查用水（阴性对照）用含标准内毒素的供试品溶液的平均内毒素含量减去供试品溶液的平均内毒素含量，计算内毒素的平均回收率。当内毒素的回收率在50200之间时，可认为在此试验条件下供试品溶液中不存在干扰因素。当内毒素的回收率不在指定范围内，应根据凝胶法章节的“1.预备实验（ii）干扰因素实验”项下的说明排除干扰因素。重复干扰因素实验以验证处理的有效
37、性。（4） 检查法（i） 方法按 “（3）预备试验下的（ii）干扰因素试验”项下操作步骤。（ii） 计算用系列溶液C生成的标准曲线计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。试验必须符合以下三个条件方有效。a. 溶液D（阴性对照）的试验结果不得大于所用鲎试剂的说明书中规定的空白值的限度。b. 阳性对照系列溶液C的检查结果要符合“3.预备实验（i）标准曲线的可靠性试验”中的要求。c. 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的回收率在50200的范围内。（iii） 结果判断若校正了稀释倍数和浓度后，由溶液A的内毒素浓度计算得到的供试品内毒素平均浓度小于供试品的内毒素限度，可判断供试品符
38、合细菌内毒素检查的要求。（5） 试剂（i） 鲎试液根据鲎试剂生产商的建议，用BET检查用水或缓冲液溶解鲎试剂，轻轻搅拌。根据鲎试剂生产商的建议，在冷冻或冰冻条件下贮存鲎试液。（ii） 鲎试剂鲎试剂系从鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）的变形细胞溶解物制备而来。该试剂仅指在符合有关权威法规的生产条件下生产的鲎试剂产品。鲎试剂除了能与内毒素发生反应外，也能与某些-葡聚糖反应。制备不与-葡聚糖反应的鲎试剂时，需用鲎变形细胞溶解物中除去可与-葡聚糖反应的G因子，或抑制G因子反应系统，这样制备得到的鲎试剂可在葡聚糖存在的情况下检测内毒素。（iii） B
39、ET检查用水（细菌内毒素检查用水）BET检查用水指注射用水R或由其他方法制取的内毒素含量低于所用鲎试剂的检测限的水。为提供相关信息，有下面的章节。细菌内毒素检查法：指导原则1. 简介革兰氏阴性菌产生的内毒素是受热原污染的药品引发毒性反应的最常见原因，它产生的热原的活性比其他来源的热原的活性要高出许多，这些内毒素属于脂多糖类。虽然也有少数的热原属于其他物质，在排除非内毒素的热原物质的前提下，调查结果通常显示：不含细菌内毒素的产品中也不存在热原。干扰因素会影响内毒素与鲎试剂之间的反应，所以它们的存在可能会掩盖产品中存在热原的事实。因此，希望用细菌内毒素检查代替药典要求的家家兔热原检查法的检验员必须
40、证明细菌内毒素检查法对供试品有效，而这种做法成功的必要条件之一是除去干扰因素。根据细菌内毒素检查法的要求，在该检查法能的使用能被视为有效之前，必须给出下面2个方面的资料。1.1 试验用到的材料符合该检查法的要求。必须保证BET检查用水和其他试剂不含内毒素，鲎试剂的灵敏度的检查结果必须与其生产商声明的灵敏度一致。1.2 考虑到待检产品可能会对试验造成的干扰，必须在存在和不存在待检产品的情况下分别开展试验，测量两组实验中鲎试剂的灵敏度；测定的2个灵敏度的值不得有明显差异。细菌内毒素检查法（2.6.14）中阐述了排除干扰因素的方法。在存在干扰因素的情况下，在证明是否已经中和或除去了该方法的干扰因素之
41、后，必须再开展一次试验。附录列举了细菌内毒素检查法的各项要求的原因，以及结果的解释。如意图以鲎试剂检查法作为分析的供选方法，取代药典专论中的家兔热原检查法，需要验证此种想法的可行性。11章给出了如何进行验证的一些指导原则。细菌内毒素的参考方法见产品专论。在专论没有特别说明的情况下，以方法A为参考。如意图使用参考方法以外的其它方法，检验员必须证明这种方法对该待检产品的适用性，并表明这种方法与参考方法在检查结果上的一致性（见13章）。2. 方法向鲎试剂中加入内毒素会引起浊度的变化、沉淀的生成或引发凝集反应；药典之所以选择凝胶法作为细菌内毒素的第一类检查的评估标准，是因为该法在判断供试品是否合格上存
42、在简明性的优势：用肉眼即可观察到是否有凝胶生成。方法C、D、E、F均为稍后研发出的定量方法：这些方法有较多的仪器要求，但如果是同种产品的大量样品的常规自动化检查，使用它们就较为简便。某些塑料或玻璃制成的试管或吸量管的表面可能会吸附内毒素，而塑料释放的物质又可能会引发干扰因素的出现。所以，应检查所用的材料。考虑到之后批次的试管或吸量管可能会与之前的批次在组分上有轻微的差异，因此，建议检验员在使用新的批次的试管或吸量管进行试验之前，先要重复材料的检查试验。首先，应将细菌内毒素检查法用作限度试验，测出待检产品的内毒素浓度的限值；接下来的检查目标是判断待检产品的内毒素浓度是否在限值的范围内。定量方法C
43、、D、E、F用于确定供试品中内毒素的含量；不管是药典还是常规质量控制，它们的最终疑问都是内毒素的含量是否超过了指定限度。设定待检产品的内毒素的浓度限值时，应将供试品的剂量纳入考虑范围；限值的设定值应能确保：只要产品的内毒素浓度小于限值，即使在指定的给药途径以每小时最大的给药剂量服药，也不会引起毒性反应。产品的内毒素含量近似等于限值时，如果内毒素的浓度较高，会出现凝胶，产品的检查结果会不合格，这是由该检查法的性质决定的：要么出现反应，要么完全没有反应。因此，该检查法不能区分接近限值（小于限值）和稍高于限制的内毒素浓度。但只要没有凝胶出现，检验员即可判定供试品的内毒素浓度低于限值。就固体产品而言，
44、每质量单位或每国际单位产品中内毒素的浓度限值应换算成每毫升供试品溶液的内毒素浓度表示方式。液体供试品（如输液制剂）的相关讨论如下。内毒素限值：在剂量的基础上，注射药物的活性成分的内毒素限度为K/MK=人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量（EU/kg）M人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。内毒素限值依产品专论中的给药途径和剂量而定。K的值见表2.6.14-15。表2.6.14-5给药途径K（内毒素IU/公斤体重*小时）静脉注射5.0放射性药物的静脉注射2.5鞘内注射0.2如产品的稀释液在试验中得到了阴性结果，是否意味着获得了最大程度的保证？阴性结果是否代表供试品的内毒素浓度低于内毒素限度，
45、而阳性结果又是否表示鲎试剂检测到的内毒素浓度近似等于或高于内毒素限度？这一点由鲎试剂的灵敏度和内毒素限度决定：最大稀释度（MVD）和它的计算式如下：MVD = 内毒素限值供试品溶液浓度/供试品溶液的浓度：当内毒素限度以质量（IU/mg）表示时，用mg/ml表示浓度。-当内毒素限度以（IU/ml）表示时，用ml/ml表示浓度。-当内毒素限度以生物单位（IU/Unit）表示时，用Units/ml表示浓度。=指凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，或指浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低点（IU/ml)的对应值。如最大有效稀释倍数不为整数，为了日常使用的便利，可取稍小于MVD的整数值（如此一来，制备的供试品溶液的稀释倍数会小于MVD）。此时，检查的阴性结果表示内毒素的浓度低于限值。不过，如果供试品的内毒素浓度低于内毒素限度，但足以与鲎试剂引发凝胶反应，在该试验条件下，检查结果呈阳性。在这种情况下，以“便利”的稀释倍数稀释的供试品的检查结果为阳性时，应将供试品以MVD稀释，重复试验。只要检查结果存在争议，就必须采用MVD进行稀释。这也突出了鲎试剂灵敏度复核试验的重要性。例待检品为50mg/ml的苯妥