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1、苍山大蒜低聚糖纯化技术研究及分子质量测定摘要：本论文旨在建立苍山大蒜中低聚糖（GOS，Garlic oligosaccharide）的分离纯化技术，并测定其分子质量。分别研究了聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、有机溶剂沉淀法和葡聚糖凝胶色谱法对GOS的纯化效果。结果表明，聚酰胺色谱柱对大蒜粗糖中蛋白质的脱除率为66.8%，糖回收率为98.9%；经DEAE-纤维素（OH-）色谱柱、乙醇分级沉淀和Sephadex G-25色谱柱纯化后，GOS的纯度为99.1%，数均分子质量为1770D，。关键词：大蒜；低聚糖；分离纯化大蒜营养丰富，在我国历来被视为药食两用的佳品。据报道，大蒜有降血脂、抗菌消炎、抗肿瘤
2、、保护肝脏和抗衰老等作用1-3。其中，大蒜中的糖类物质是蒜中的主要活性成分之一4-8。大蒜低聚糖属杂果聚糖8-10，具有益生元的作用11。低聚果糖有双向调节人体肠道微生态的功能，且低聚果糖很难被人体消化吸收，是一种低能量的糖，不会引起肥胖。低聚果糖作为一种水溶性膳食纤维，能降低血清胆固醇和甘油三酯含量，所以低聚果糖也可作为高血压、糖尿病和肥胖症等患者使用的甜味剂12。由于大蒜产地和品种等不同，对经分离纯化得到的大蒜多糖性质的研究报道并不一致。苍山大蒜的外形较差，不宜作为商品直接出售。但苍山大蒜富含低聚糖，具有较高的开发利用价值。本文旨在建立苍山大蒜低聚糖的分离纯化技术，并测定其分子质量，为大蒜
3、低聚糖的进一步研究及应用提供基本方法。1 材料与方法1.1 材料与试剂大蒜 苍山大蒜；聚酰胺（30-60目） 国药集团上海试剂公司；DE-52 Whatman公司；Sephadex G-25、蓝色葡聚糖-2000 Pharmacia公司；果糖标准品 Amresco公司；多糖标准品 Fluka公司；其它试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备TDZ5-WS型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；IGJ0.5冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；752型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；BS-100A自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司；高效液相色谱系统 日本岛津公司；高效液相色谱柱 奥秘
4、BauloSB5-2546-c18-060 C18柱（4.6 mm250 mm，5 m）。1.3 技术路线鲜蒜高温灭酶破碎提取沉淀冻干纯化1.4 方法大蒜粗糖提取采用本实验室前期建立的方法13。1.4.1蛋白质脱除效果的比较研究Sevag法对蛋白质的脱除效果研究：称取10.0g粗糖干粉溶于100mL蒸馏水中，配成粗糖溶液，加入20mL的Sevag试剂（氯仿：正丁醇=5：1，V/V），剧烈振摇20min，静置30min，3000r/min离心15min，收集上清液，重复操作数次，至无变性蛋白质出现为止。考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量14，苯酚-硫酸法测定总糖含量15，计算糖损失率和蛋白质脱
5、除率。聚酰胺柱色谱法对蛋白质的脱除效果研究：取一定量的大蒜粗糖上样（2.5cm34cm），蒸馏水洗脱，分别采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法测定洗脱液中的总糖和蛋白质含量。计算糖损失率和蛋白质脱除率。量取7mL聚酰胺装柱（1cm20cm），2g粗糖上样，蒸馏水洗脱，至无糖洗出为止。测定洗脱液中蛋白含量，计算动态吸附容量。1.4.2 大蒜低聚糖的DEAE-纤维素色谱柱法纯化经脱蛋白后的大蒜低聚糖1.5mL上样（f8mm170mm），上样浓度为5%（g/mL），梯度洗脱，流动相分别为：蒸馏水，0.05mol/L NaCl，0.10mol/L NaCl，0.15mol/L NaCl，0.20m
6、ol/L NaCl，0.25mol/L NaCl，0.20mol/L NaOH。自动部分收集器收集洗脱液（3min/管），共收集98管，苯酚-硫酸法测每管总糖含量，绘制洗脱曲线。收集主要组分，采用HPLC测定其分子质量分布。色谱条件为：GPC色谱柱：SB-802.5；流动相：三蒸水；流速：0.8mL/min；柱温：30；柱压：3.0MPa；示差折光检测器检测。1.4.3 大蒜低聚糖的沉淀法分级纯化称取2.0g经DEAE-纤维素色谱柱纯化得到的中性糖，溶于10mL蒸馏水。加10mL 95%（V/V）乙醇，4静置2h，3500r/min离心15min，收集沉淀（记作沉淀1），上清液继续加10mL
7、95%（V/V）乙醇，收集沉淀2，重复上述步骤8次，最后一次醇沉后，上清液水浴挥干，收集干物质。HPLC测定不同沉淀组分的分子质量分布（方法同1.4.2）。1.4.4 大蒜低聚糖的葡聚糖凝胶Sephadex G-25色谱柱法纯化取分级沉淀5至8的合并样品10mg溶解上样（f12mm300mm），蒸馏水洗脱，流速5d/min，自动部分收集器收集（7min/管），测定洗脱液中总糖含量，绘制洗脱曲线，收集主峰部分，真空浓缩，冷冻干燥。HPLC法检测其分子质量（方法同1.4.2）。2 结果与分析2.1 蛋白质脱除效果大蒜粗糖中蛋白质含量为3.5%0.1%。Sevag法脱蛋白需重复7次，才能脱除粗糖中的
8、游离蛋白，糖损失率为37.0%，蛋白质脱除率为71.4%。聚酰胺柱色谱法脱蛋白一次，糖损失率1.1%，蛋白质脱除率为66.8%，聚酰胺对蛋白质的动态吸附容量为6.010.03mg/mL。说明聚酰胺柱色谱法具有良好的蛋白质脱除效果。2.2 DEAE-纤维素色谱柱对大蒜低聚糖的纯化效果DEAE-纤维素（OH-）色谱柱对大蒜低聚糖的分离效果见图1。由图可知，DEAE-纤维素（OH-）色谱柱可把脱蛋白后的大蒜低聚糖分离成3个组分，所用洗脱液依次为蒸馏水、0.05mol/L NaCl、0.20mol/L NaOH。收集组分主峰部分，HPLC分析结果见图2，由检测结果可知，分子质量分布不均一，需进一步纯化
9、。图1 大蒜低聚糖在DEAE-cellulose（OH-）色谱柱上的洗脱曲线注：H2O：1-30管，0.05mol/L NaCl：31-46管，0.10mol/L NaCl：47-56管，0.15mol/L NaCl：57-65管，0.20mol/L NaCl：66-71管，0.25mol/L NaCl：72-78管，0.20mol/L NaOH：79-98管图2 大蒜低聚糖DEAE-cellulose（OH-）色谱柱分离主峰部分分子质量分布检测结果注：图中横坐标为时间(min)，纵坐标为影响强度(mV)2.3沉淀法对大蒜低聚糖的分级纯化效果采用乙醇分级沉淀法对中性糖进行纯化，得到沉淀曲线（图
10、3）。沉淀量分别为：1.68%、1.37%、3.47%、41.70%、15.26%、7.25%、4.71%、3.13%。通过HPLC检测沉淀1至沉淀8，各沉淀组分分子质量分布见图4。由检测结果可知随乙醇添加量的增多，沉淀组分的主峰所占比例逐步提高，由沉淀1的72.3%上升为沉淀8的96.6%。沉淀5至沉淀8纯度均在96%以上，且分子质量均在1800D左右，可以认为是同种物质，合并，继续纯化。 图3 大蒜中性糖的乙醇分级沉淀曲线ABCDEFGH图4 分级沉淀各级分HPLC图注：A：沉淀1；B：沉淀2；C：沉淀3；D：沉淀4；E：沉淀5；F：沉淀6；G：沉淀7；H：沉淀8; 图中横坐标为时间(mi
11、n)，纵坐标为影响强度(mV)2.4葡聚糖凝胶Sephadex G-25色谱柱对大蒜低聚糖的纯化效果葡聚糖凝胶Sephadex G-25色谱柱可除去糖样中的小分子杂质，分离结果见图5，主峰部分的HPLC检测结果见图6。由图5可知，经Sephadex G-25色谱柱分离的大蒜低聚糖为对称均一峰；由图6可知，Sephadex G-25色谱柱分离的大蒜低聚糖主峰含量为99.1%，Mw/Mn=1.31，数均分子质量为1770D。图5 葡聚糖凝胶Sephadex G-25洗脱曲线图6 苍山大蒜低聚糖样品HPLC图注：图中横坐标为时间(min)，纵坐标为影响强度(mV)3结论聚酰胺柱色谱法具有良好的蛋白质
12、脱除效果，蛋白质脱除率为66.8%，糖回收率为98.9%，动态吸附容量为6.010.03mg/mL；DEAE-纤维素（OH-）色谱柱可将大蒜糖分为3个组分，其主峰部分采用乙醇沉淀法可分为8个组分，其中沉淀5至8纯度较高；Sephadex G-25可除去小分子杂质，所得GOS的纯度为99.1%，Mw/Mn=1.31，数均分子质量为1770D。参考文献1 孔君社，高孔荣大蒜的化学与药效及利用J广州食品工业科技，1994（增刊）：8-112 陈能煜，伍睿，陈丽，等大蒜的功能性质及开发J中国食物与营养，2005，4：20-223 Muhammad S A，Monika P，Nessar AAged g
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