病毒的形态学诊断.docx

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1、实验十病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验目的（一）观察病毒包涵体，并掌握其诊断意义。（二）掌握病毒的形态并了解病毒包膜的获得。（三）了解病毒培养的三种方法。（四）掌握病毒学中主要血清学反应的原理（五）熟悉病毒血凝抑制试验的测定过程 内容（一）病毒的形态学诊断1. 病毒的电镜照片（示教）2. 狂犬病毒包涵体（示教）3. 麻疹病毒包涵体（示教）（二）病毒的培养法（录像）1. 病毒的动物接种法2. 病毒鸡胚培养法3. 病毒的组织培养法（三）血凝抑制试验（操作）1、 病毒的形态学诊断病毒形态学研究方法可分为两种：一种是应用电子显微镜技术，观察其大小，形态及排列特征，以帮助诊断；另一种是应用光学显微

2、镜通过涂片染色或切片染色，观察包涵体。病毒感染细胞所产生的包涵体，其特征基本是固定的，故对病毒性疾病的诊断具有一定价值。【方法】（一）病毒的电镜照片（示教）观察腺病毒、疱疹病毒的电镜照片，注意其形态结构、大小、排列、及其包膜的形成。（二）狂犬病病毒内基（ Negri ）包涵体（示教）用高倍镜或油镜观察经HE （苏木紫-伊红染色）染色的死于狂犬病的犬脑组织切片，注意包涵体在细胞内的形态、位置及染色性。（三）麻疹病毒包涵体（示教）用高倍镜或油镜观察经麻疹病毒培养后，HE染色的人胚或羊膜细胞标本片，注意包涵体在细胞内的位置、形态、染色性以及细胞融合情况。2、 病毒动物接种法实验动物在病毒学研究中有四

3、方面用途：分离鉴定病毒，如乙脑病毒；连续传代通过，以减弱有毒株对人的致病力，如狂犬病病毒；制备抗血清；病毒致病机理的研究。常用的实验动物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、猴等。在病毒学研究中，动物接种时为避免动物本身可能带有病毒，多采用实验室自己繁殖的动物。首先根据研究目的选择动物种类，对病毒致病机制的研究，则选择愈接近人类的高等动物（例如灵长类）研究结果愈有价值；其次要注意动物的年龄、性别和接种的途径等各种因素，一般年幼的动物比成年动物对病毒的敏感性高。至于接种的途径应根据病毒的嗜性决定，例如脑炎病毒以脑内注射最敏感。（一）小白鼠尾静脉接种（录像）【材料】1. 动物：小白鼠2. 病毒悬液

4、3. 碘酒、酒精、二甲苯、无菌注射器、 4 号针头及小铝匣【方法】1. 将小白鼠固定在小铝匣内，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球连续擦尾部皮肤（必 要时用二甲苯擦）使血管扩张。2. 尾背和左右两侧三根血管皆为静脉，可选一根扩张较好的静脉作接种用。左手拇指捏住尾部的远端，向下弯45 ，右手持注射器，于弯处进针静脉，推液毫升。注意：推注时遇阻力且皮下隆起发白时，表示针头不在血管内应拔出重新进针；如针头在血管内，推注时不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液体而后退。接种后逐日观察动物发病情况。（二）小白鼠鼻内接种（录像）【材料】小白鼠、流感病毒鼠肺适应株病毒悬液、无菌小试管、无菌毛细管、麻醉

5、用乙醚、棉球及小玻瓶。【方法】1. 首先将沾有乙醚的棉球放入一清洁小玻瓶内。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，将其头部塞入瓶 口，进行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太浅或太深，太深时易遭致麻醉死亡或非特异性吸入性肺炎， 太浅则易在滴种时打喷嚏。2. 用无菌毛细吸管吸取病毒悬液少许，连同毛细吸管插在无菌试管中备用。3. 用左手将小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其头部朝前并呈仰卧位置，另一手取事先吸有病毒悬液的吸管，慢慢滴出一点于滴管口而不使其自然掉落，呈悬滴状。将悬滴靠近动物鼻尖，动物在呼吸时自然吸入，一般为毫升，不宜过多。4. 小白鼠慢慢苏醒，在饲养盒中逐日开始发病，发病的症状常为毛耸、

6、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸体可观察到肺炎或血性病灶。（三）小白鼠脑内接种（录像）【材料】脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎病毒）悬液。脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加10脱脂奶盐水研磨成 101悬液，然后用 3000 转/分离心沉淀30 分钟，吸取上清液供接种用。小白鼠：3周龄，体重68克。无菌毫升注射器及针头（ 4 号）、煮针锅、碘酊、棉签。【方法】1. 以无菌毫升注射器抽取脑炎病毒悬液毫升，去除注射器内的气泡。2. 取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指捏住小白鼠的头部，左手手掌轻轻按 住小白鼠的体部。3. 右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠颞部皮毛（不碰到眼）。4. 右手拿注射器在小

7、白鼠颗部（眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向）刺入，进入颅腔，进针23毫米，不要插得太深，注射量为毫升。5.注射完毕，将用过得注射器放入煮针锅内煮沸消毒。动物一般在34天后开始发病，食欲减退，活动迟钝，毛耸，震颤，慢慢发展为麻痹，瘫痪而死亡。本法适用于一些脑炎病毒的分离培养。三、 病毒鸡胚培养法鸡胚培养法常用于痘类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、生产疫苗以及研究病毒性质等。鸡胚和实验动物一样，为一整体动物，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的组织分化程度低，病毒易于繁殖，感染了病毒的膜结构和液体中，含有大量病毒；鸡胚来源充足，操作简单、通常本身是 无菌的，对接种的病毒不产生抗体为其

8、优点，但除产生痘疱的病毒及引起鸡胚死亡的病毒外，通常不产 生特异性的感染指征，必须利用第二个试验系统来测定病毒的增殖。常用的鸡胚接种方法有四种，即绒毛尿囊膜上接种法、羊膜腔接种法、尿囊接种法及卵黄囊接种法。根据不同病毒和不同目的采用合适的接种方法。（一）尿囊腔接种法（录像）【材料】副流感病毒10 3稀释液，1012日龄鸡胚、无菌1毫升注射器及7号针头、电动磨蛋器、检蛋灯、 弯头小镣子、蛋架、碘酒棉球、胶布、大头针、无菌试管、无菌毛细吸管。【方法】1 .选用1012日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察鸡胚是否存活，根据如下：小血管是否清晰； 胚胎是否活动，观察小鸡的眼睛黑点是否移动；蛋白一边和胎盘一边是

9、否界限分明，蛋白一边较亮， 胎盘一边暗红色，如果胎盘一边发黑或苍白都表示胚蛋已死亡。用铅笔标明天然气室，鸡胚及大血管位置，然后在绒毛尿囊膜发育区避开大血管的地方作一记号， 定为注射入口。绒毛尿囊膜区血管丰富，在照视时呈现红色，几乎占据鸡蛋的二分之一。2 .用碘酒消毒注射入口和天然气室端的蛋壳，再用电动磨蛋器于注射入口和天然气室端的蛋壳上 磨一小孔，勿伤及卵膜。3 .用大头针通过火焰消毒后刺穿气室端所开小孔的卵膜，这样可避免在注射时液体回流出来。4 .将鸡胚横卧于蛋架上，用无菌1毫升注射器抽取病毒液体，针头于卵壳成30。交角，由注射小孔刺入厘米，注射毫升（图10-1 ）。5 .注射完结用胶布封口

10、。封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。用过的注射器用煮沸法 消毒，鸡胚放入 3537 c培养。6 .注射后次日，逐日观察鸡胚生活情况，孵育4872小时后移入4c冰箱。注意鸡胚必须直立，令气室端朝上。7 .收获尿囊液之前取出鸡胚，用碘酒消毒气室端，并用银子击破气室端卵壳，沿气室边缘小心打开一大缺口，然后用小镣子撕去卵膜及撕破绒毛尿囊膜，最后用毛细管吸取尿囊液，一般可吸得45毫升。8 .滴定尿囊液的病毒血凝效价。尿囊接种法适用于某些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒、新城鸡瘟病毒等的培养，惟分离培 养不如羊膜腔接种法阳性率高。卵白.,尿囊液（二）绒毛尿囊膜上接种法羊水气室 卵黄囊（录檄）10

11、-1鸡胚尿囊腔接种法牛痘苗病毒10 3稀释71013日龄鸡胚、橡皮乳头、眼科镣子或小剪刀、无菌培养皿、无菌生理盐水，其余同尿囊腔接种法。【方法】1 .选用1013日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察是否活胚蛋，用铅笔划下绒毛尿囊膜发育的界限。2 .将胚蛋横卧于蛋座上， 使其绒毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒绒毛尿囊膜部位和天然气室端的中心部，待干后即用磨蛋器轻轻在绒毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每边一厘米许），磨破卵壳而不使卵膜破裂，同时用磨蛋器于气室端开一小孔。注意：已磨好之鸡胚必须于12小时内接种，否则绒毛尿囊膜易与卵壳粘着。3 .用分离针或大头针通过火焰消毒，穿通天然气室端所锯小孔；并用分离针或大头

12、针轻轻划破卵壳，露出三角形卵膜，最好将分离针或大头针30。角度自上往下压迫卵膜一个小口，这样不致损伤绒毛尿囊膜。4 .立即用橡皮乳头在天然气室一端小孔吸气23次，目的将天然气室的空气吸去，而上面所开的洞口进入空气，形成一个人工气室，可在照蛋灯上照视一下，看天然气室是否消失，如未消失则尚需再 吸气数次（图10-2 ）。5 .用小镣子通过火焰灭菌，稍待冷却后将三角形窗口的卵膜撕去、暂时盖以无菌培养皿防止污染， 然后用消毒注射器吸取牛痘苗悬液（10 3稀释液，内加适量的链霉素及青霉素），揭去培养皿，于窗口滴入毫升病毒液，注毕后窗口用胶布封口，封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰，烧去余碘。用过的 注射器

13、煮沸消毒。6 .孵育于37c温箱，每日观察生活情况，接种 10 3稀释的牛痘苗后的鸡胚一般不死亡，但也可能 在3天之后发生死亡， 如发现死亡则立即放入普通冰箱，如不死亡则培养 45日后放入普通冰箱， 等待观察检查。7 .将感染病毒的鸡胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工气室面，然后用镣子撕去胶布并将卵壳的三角形窗口扩大，以便剪取绒毛膜，此时在明亮处可清楚地看到牛痘斑，呈白色点状，有时融合成一堆或一 片。8 .左手用小镣子镣起绒毛尿囊膜，右手用小剪顺卵壳四周剪下绒毛尿囊膜放入无菌培养皿内，并用无菌生理盐水洗涤 12次，再将膜张开，膜上牛痘斑就看得更为清楚。绒毛尿囊膜上接种法，除适用于天花，牛痘等病毒外

14、，尚适用于单纯疱疹病毒和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、单疱疹病毒那样具有明显的病斑绒毛尿囊膜羊水副流感病毒10 3稀释7910日龄鸡胚、灭菌液体石蜡、其余同尿囊腔接种法【方法】9 .所用鸡胚在使用前一天，将鸡胚直立卵盘培养，使其胚胎向上，便于操作。10 .接种前检查鸡胚生活情况，并用铅笔画出天然气室和胚胎的位置，然后用磨蛋器沿天然气室的边缘和胚胎位置近处，锯一方形小窗（每边约1厘米许，如图10-3）。11 用小镣子挑去方形卵壳和撕去卵膜，再用无菌吸管，吸取石蜡油少许，滴入2滴，石蜡油在气室面的卵膜上很快散开，使膜透明，这样在鸡蛋照明灯或检蛋灯上，可清楚地观察到整个鸡胚。12 用无

15、菌1毫升注射器抽取少许流感病毒液体，将鸡蛋直立于照明灯或检蛋灯上，针头自窗口对 着鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜，羊膜腔、推动注射器，注入毫升，针头刺入时注意勿伤及鸡胚本身， 最好从小鸡的颈部空隙中插入。13 注射完毕后，用胶布封口（胶布先经碘酒消毒和通过火焰烧去余碘处理）。用过的注射器煮沸 消毒处理。鸡胚放入 3537 c培养4872小时。14 自注射后次日起逐日检查鸡胚的生活情况，2日以内死亡者多为非特异性损伤而致死；2日后死3亡者视为特异性死亡，流感或副流感病毒10稀释注射时，一般不引起死亡。收获病毒之前将鸡胚移入普通冰箱1824小时，将鸡胚冻死，以减少收获时的出血。15 冰箱取出鸡胚，碘酒消

16、毒鸡蛋气室端，撕去胶布并将蛋壳窗口扩大，用小银子撕破卵膜及绒毛 尿囊膜，然后用毛细管吸出尿囊液弃去，尿囊液吸完后，左手持银子镶住羊膜腔，右手以毛细吸管插入 羊膜腔吸取羊水，一般羊水可吸出一毫升左右。16 滴定羊水的病毒血凝效价。羊膜腔接种方法适用于一些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒及流行性腮腺炎病毒等的分离。卵黄囊图10-3羊膜腔接种四、病毒细胞培养法及病变观察（录像）细胞培养法是目前培养病毒应用最广的一种培养方法，其优点是（1）经济适用，结果正确且敏感；（2）较实验动物易于控制。细胞培养法多应用于病毒的分离培养，进行血清中和试验及制造疫苗和抗原等方面。很多组织细胞，包括鸡胚、鼠胚、各种动

17、物的肾组织细胞，人胚羊膜组织细胞或流产胎儿组织细胞（应在死后6小时内采取，因时间过长，组织细胞生长成功率下降）等均可作细胞培养的来源。细胞的选择主要依据组织细胞对病毒的敏感性。能引起病变的组织细胞，往往取自病毒的自然宿主，特别是引起疾病的宿主的某些脏器组织细胞。人类病毒，用人或猴的组织细胞较敏感，但这不是绝对的，如地鼠肾细胞较人肾细胞对流行性乙型脑炎病毒敏感。（一） 原代细胞培养法【材料】910日龄鸡胚、Hanks氏溶液、胰酶溶液、无菌小剪、镣子、无菌培养皿、毛细吸管、吸管、沉 淀管、无菌细胞培养管（抗生素空瓶）、100毫升无菌玻璃瓶或三角烧瓶、备有四层纱布的玻璃漏斗。【方法】1 .用碘酒消毒

18、鸡胚蛋气室外壳，并将它直立于蛋架上，以银子将鸡胚取出放入无菌培养皿内，去头 爪及内脏。2 .用小剪在培养皿内将胚胎剪成小块（45毫米3）,加Hanks氏溶液（约10毫升）冲洗，静置1-2分钟后，用毛细吸管吸取液体。依同法再洗涤2次，将血球充分洗去。3 .用镣子将组织块放入无菌玻璃瓶或三角烧瓶内，加入1015毫升胰酶溶液，37c水浴20分钟,中间摇动几次。由于胰酶的作用可使大量细胞游离，液体变混。经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离 心沉淀（ 1000转/分以内）5分钟，吸取上清液，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含5080万细胞悬液以作单层细胞培养。4 .每一细胞培养

19、管，注入细胞悬液1毫升，盖好瓶塞，并将瓶略加摇动，横卧于有槽木架上，使细胞均匀平铺于管壁。置 37c温箱孵育，一般 4小时，细胞附着于管壁，48小时可长成单层，此时即可调换营养液，接种病毒。（二）传代细胞培养法从人及动物组织，特别是肿瘤组织，经过多次传代可建立传代细胞系。这种细胞能无限地传代，但 并不是所有的组织细胞都能建立传代细胞。有一些传代细胞对病毒敏感范围较广，曾被利用作病毒的分 离和鉴定。如HeLa细胞，Hep 2细胞及KB细胞。HeLa细胞对脊髓灰质炎三型病毒，腺病毒及大多数实验室适应的ECHOW毒都敏感。Hep-2细胞也曾用来分离脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A组病毒、腺病毒、RS病毒。H

20、eLa细胞来自子宫颈癌，Hep- 2细胞来自喉癌，而 KB细胞来自上腭癌。由于传代细胞有致肿瘤作用，目前仅用做病毒的分离鉴定及一些病毒学的研究而不能用于疫苗的生产。【材料】单层细胞培养瓶，营养液，胰蛋白酶溶液，无菌吸管，无菌细胞瓶。【方法】1 .将成片细胞的生长液倒掉，用Hanks液洗一次。2 .加入适量的胰蛋白酶，37c孵育1分钟。3 .将细胞瓶倒放，细胞在上，胰酶在下，继续孵育37c 510分钟。4 .将胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生长液，用10毫升吸管吹打分散细胞。5 .用生长液按原量 34倍稀释，即一瓶细胞能传34瓶。（三）细胞培养接种病毒的方法及病变观察（示教）【材料】单层细胞培养管、

21、营养液、Hanks溶液、无菌毛细滴管和腺病毒稀释液。【方法】1 .取已长成单层细胞的培养瓶二只，用无菌毛细滴管吸去管中液体，用Hanks溶液洗二次。2 .用无菌的1毫升吸管吸稀释的腺病毒液毫升加入一只单层细胞培养瓶中，另一只加毫升营养液不接种病毒作为对照，细胞瓶放平，使其接触整个细胞层，置37c作用1小时，使病毒吸附到细胞上。3 .取出单层细胞瓶，每只中加入营养液毫升，盖紧后置37c孵箱中培养12天。4 .取出细胞在低倍显微镜下观察，注意种毒与对照二管的细胞形态，排列等。注：为方便保存，此处观察的细胞已经过固定和染色。五、血凝抑制试验血凝抑制试验系利用血凝素特异性抗体与病毒表面相应血凝素相互作

22、用，使病毒血凝现象抑制的试 验。血凝抑制试验适用于具有血凝素的病毒，试验必须预先滴定病毒的血凝效价，然后采用一定量的病 毒，通常是加入 4个血凝单位的病毒，在与血凝滴定试验相同的反应条件下来进行测定。（一）血凝效价的滴定【材料】收获的尿囊液（病毒悬液）、32孔有机玻璃板。ml移液器、移液头、小试管一支、%鸡红细胞悬液、生理盐水【方法】按下表进行，其操作程序为：1 .将有机玻璃板孔从 110号进行编号，从第一孔起直至第10孔，每孔加生理盐水。2 .将尿囊液在试管中作 1 ： 5稀释，即吸取生理盐水，加入尿囊液。然后吸取1 ： 5稀释的尿囊液 ml 加入到第1孔，混匀后（吹吸 3次），从中吸出 m

23、l移入第2孔，如此对倍稀释直至第 9孔，于第9孔 中吸出ml,弃入消毒缸内。第 10孔不加尿囊液作为对照。3 .自第10孔起，反方向每孔补充生理盐水ml。1 .自第10孔起，反方向每孔加入%鸡红血球 ml,摇匀后放室温静止45分钟，观察结果，并确定血（球）凝（集）效价孔号12345678910生理盐水(ml) 尿囊液(m)+、*、+、+、+、* +、+、+、病毒稀释度1 ： 101 ：201 ：401 ：801 ：1601:32D1:6401:12901 ：2500对照补充液(ml)(生理盐水)各%鸡红细胞 悬液(ml)各*为1 ： 5稀释尿囊液结果观察：凡出现凝集者，红细胞平铺孔底，呈倒张的

24、伞状，边缘有卷起的趋向。凝集特别显着者为+ + + + ,次之为+ + + ,凝集清楚可见者为+ + ,稍呈凝集者为十;阴性者血球沉于孔底中心，呈 钮扣状。血凝效价：指呈现+凝集时病毒的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。若 1个血凝单位为1 : 640,则4个血凝单位为 1 ： 160。(二)血凝抑制试验【材料】4个血凝单位的病毒液，1 ： 5稀释的抗血清，32孔有机玻璃板，ml移液器，移液头，鸡红细胞悬液，生理盐水【方法】按下表进行，其操作程序为：1 .将有机玻璃板孔从 1-10号进行编号，从第一孔起直至第9孔，每孔加生理盐水，第 10孔加。2 .于第1孔和第8孔中各加入1 ： 5稀

25、释血清。将第1孔混匀后从中吸出移入第 2孔，如此作对倍稀释直至第7孔，于第7孔中吸出弃入消毒缸内。第8孔为血清对照。3.于第1至第7孔中各加入 4个血凝单位的病毒液，第9孔亦加入病毒液作病毒对照。4.稍加振摇后，每孔加入鸡红细胞，室温静置45分钟，观察结果。孔号1234567血清 对照病毒对照红细胞 对照生理盐水(ml) 抗血清(ml)十、*、+、*+、+、X、十、十*血清稀释度1 ：131 ：201通1 ：801 ：1601 ：3201 ：6404个血凝单位病毒(ml)各%鸡红细胞悬液(mi)各*为1：5稀释的抗血清结果：红 细胞对照孔，血球沉于孔底中心，呈钮扣状，表明红细胞无自凝现象；病毒

26、对照孔，呈现 + + + +凝集，表明病毒血凝功能正常；血清对照孔，血球沉于孔底中心，呈钮扣状，表明血清中无凝 集因子；测定孔中，如血球沉于孔底中心，呈钮扣状，表明血清中有相应的血凝抑制抗体，为阳性孔； 反之凝集者为阴性孔。血凝抑制效价：呈完全血凝抑制时的最高血清稀释度。附录：附录:1 .鸡胚的准备和发育过程病毒的鸡胚培养，多采用来亨鸡卵，其优点为卵壳色白而薄，易于照视，如不能得到，一般家鸡卵也可应用。孵育温度通常在3839c之间，相对湿度 4060%。孵育45天后即可在检蛋灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。未受精之鸡蛋于4日后仅见模糊卵黄黑影，无鸡胚迹象。活的鸡胚于4日后即可见清晰之血管小网，

27、 中有刚刚发育之胚胎，自45天以后逐日检查胚胎生活情况，逐日增大之鸡胚则可见到清楚之绒毛尿囊膜上的血管及活动之胚胎。受精卵在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄中形成细胞，名为胚点，在适宜温度下即 能继续分裂发育，形成中、外、内三胚层，逐步发育成各种器官。鸡胚的最外层为石灰质之卵壳，上有细孔以行气体交换，下层为壳膜，很容易与孵壳分开，壳膜的 功能是使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换，因此在孵育鸡胚时需要一定的湿度和气流，如果 湿度太低，鸡胚就容易脱水，引起鸡胚死亡，气流同样是重要的，孵育时如空气不流通，亦可造成鸡胚 的死亡。因此壳和壳膜不是简单的覆盖，而是本身具有维持内部生命的功能

28、。气室的功能是呼吸和调节 压力，壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，外为绒毛膜，系外胚层形成，内为尿囊膜，由内胚层形成， 两膜结合之间为中胚层，因此绒毛尿囊膜是尿囊膜在生长发育过程中与绒毛膜相连而成，血管较多，起 着胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。鸡胚孵育至第3天即出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐水溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第1213天，尿囊液开始变得浑浊，若将其冷却即可见有沉淀物形成，主要是尿酸盐类。因此，在制备流感病毒抗原时，通常用盐水将尿液加以稀释后放4c备用，这样可减少尿酸盐的

29、沉淀，尿液量在鸡胚发育的第11至13天最高，平均为 6毫升。羊膜为胚胎最内层包被，系由外胚层组成，羊膜腔盛有羊水，胎体浸泡于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水，后来则蛋白质含量增加，羊水量平均为 1毫升左右。卵黄囊附着于胚胎，卵黄囊膜系由内胚层的细胞组成，对培养病毒有重要作用，内包有卵黄，为胚 胎之养料，卵白位于卵之锐端，为胚胎发育晚期之养料。2 . Hanks溶液配制，先配成下列甲、乙两种原液。原液甲：NaClKClMgSO-160克加入800量升双蒸水A7H2O8克2克MgCl2 -HO2克CaCl22.8克溶于100毫升双蒸水将上述二溶液混合后加双蒸水至1000毫升，加2毫升氯仿作为防腐剂

30、，保存于4c冰箱原液乙：N&HPO - 12H2O304 克KH2PO1.2克 4加入800毫升双蒸水葡萄糖20克0. 4%酚红液100 毫升加入双蒸水使成1000毫升，加入2毫升氯仿作为防腐剂，保存于4c冰箱，使用前按以下比例配成。原液甲1份原液乙1份双蒸水18份以9磅10分钟灭菌，此溶液存于 4c冰箱，可使用1个月。3 .营养液的配制Hanks液1000毫升水解乳白蛋白5克配制成%之水解乳白蛋白溶液，分装小瓶以9磅10分钟灭菌，使用前再加入510%无菌牛血清，并调整pH （用NaHCO溶液校正）。4 . %胰蛋白酶溶液配制胰酶2.5克Hanks使用液1000毫升青霉素10毫升（最终浓度10

31、0单位/毫升）链霉素10毫升（最终浓度100单位/毫升）加胰酶和抗生素于 Hanks液中，震荡使其溶解，加压过滤除菌，分装，20 c低温备用，一瓶最好用一次，不宜反复冻融。3.流感病毒的分离和鉴定过程：【材料】患者早期漱口液（用大管肉汤收集）、910日龄鸡胚、1毫升注射器及针头（16号）、抗生素（每毫升含青霉素2万单位及2万微克链霉素）、无菌小试管、吸管、鸡红细胞、已知各型流感免疫血清。【方法】病人急性期的漱口液| （抗生素处理）活鸡胚培养（羊膜腔接种）| 孵育35 c 72小时收获羊水进行血凝滴定（+）（-）血凝抑制试验与盲传鸡胚，方法同上，如又为补体结合试验定型阴性则须再盲传一次，一共三次

32、,仍为阴性则报告阴性（一）分离标本处理：采集之标本保存于冰壶内，及时进行分离，如不能进行分离则需保存于20C以下，漱口液经低速沉淀后，吸取上清液1毫升，加抗生素毫升。取1012日龄鸡胚一只，将处理过的材料毫升，接种于鸡胚尿囊（初次分离多用羊膜腔接种，此处由于初学，羊膜腔接种难以掌握，暂以尿囊接种代替）。接种完毕后孵育 35 C , 72小时后收获尿囊液。孵育72小时后将鸡胚置 4c冰箱过夜，目的是使鸡胚冻死并不易在收获尿囊液时出血，注意放入冰箱时必须使天然气室（大头）朝上。自冰箱取出鸡胚，放在蛋架上（一般是大头朝上），用碘酒消毒气室端卵壳，然后持银子小心击 破气室端卵壳并打开之。再用眼科小镣子

33、撕破卵膜及绒毛尿囊膜，以便用毛细管吸取尿囊液，将尿囊液 吸入中号试管内。将尿囊液进行血凝滴定，以测定是否有病毒生长。（二）鉴定将已测定过血凝的尿囊液，用已知各亚型血清进行抑制试验。将尿囊液与已知各型血清进行补体结合试验。（一般补体结合试验所用抗原多为可溶性抗原，具 有型的特异性；血凝试验中抗原为颗粒性，具有株的特异性；补体结合试验所用的血清以豚鼠制备的免 疫血清为宜）。根据各个步骤的试验结果，判断所分离的病毒属于何种病毒。2.鸡红血球的制备取 10ml 鸡血加入枸橼酸钠1ml ，迅速混合，存放于4冰箱，时间不超过3 天，使用前取红细胞悬液加510倍体积生理盐水洗涤3次，最后一次以2000转/分

34、的速度沉淀10分钟，洗涤后的红细胞按体积用生理盐水稀释成悬液备用。3 ELISA 试剂：包被液和稀释液， 0.01M Na 2CO3 NaHCO 3缓冲液Na2CO31.59gNaHCO 32.93g加蒸馏水至1000ml该液应保存于4，一次配制应用期不宜超过10 天。洗涤液（磷酸缓冲液）NaCl8gNa2HPO4 12H2O20gKH 2PO40.2gTween 20加蒸馏水至1000ml酶标羊抗人抗体用洗涤液（不加Tween 20，改加1兔血清）稀释。底物液（柠檬酸缓冲液）0.2M Na 2HPO4（28.4g/L ）0.1M C6H8O7 H2O （21.02g/L）H 2O50ml邻苯二胺（临用时加）60mg30%H2O2 （临用时加）15ml终止液（2M硫酸）浓硫酸22ml188ml蒸馏水