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1、胃癌鸟氨酸脱羧酶基因表达及临床意义的研究阎云飞，刘斌，徐春晓，辛佳璇，王伟，刘贤锡(山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所, 济南250012)摘要目的：从mRNA和蛋白质水平研究鸟氨酸脱羧酶在胃癌中的表达，探讨其在胃癌形成中的作用。方法：采用半定量RT-PCR技术检测胃癌及相应癌旁组织中ODC mRNA的表达量，采用wetern-blot在蛋白质水平检测胃癌及相应癌旁组织中ODC的表达量，并做统计学分析。结果：21例胃癌组织中ODC在mRNA和蛋白质水平的表达量均高于癌旁组织，差异显著（P0.01）。低分化胃癌组织中ODC基因表达量显著高于高中分化组（P0.01）。结论：ODC表达增强在胃
2、癌发生发展中起重要作用，提示ODC可作为胃癌的基因诊断与治疗的靶点。关键词胃癌；鸟氨酸脱羧酶；基因表达中图分类号:Q784 文献标识码:AExpression and clinical implication of ODC in gastric carcinomaYunfei Yan,，Bin Liu，Chunxiao Xu，Jiaxuan Xin，Wei Wang，Xianxi Liu( Institute of Biochemistry and Molecular Biology , School of Medicine , Shandong University , Jinan 2500
3、12 , China)【ABSTRACT】Objective: To investigate the expression of ODC in both mRNA and protein. Methods: We extracted total RNA from 21 surgically resected specimens of gastric cancer and normal mucosa closed to lesion and conducted the reverse transcription polymerase chain reaction with optimal con
4、dition. Semi-quantitatively we compared the mRNA expression level of ODC between malignant and normal mucosa. Total protein was extracted from the same 21 surgically resected specimens. We adopt western-blot analysis to compare the protein expression level of ODC between cancer lesion and normal muc
5、osa. R: The mRNA and protein expression of ODC in lesion of gastric carcinoma was significantly higher than that in contiguous normal mucosa. (P0.01) CONCLUDE: ODC exert great influence on occurrence and development of gastric cancer, and may play a pivotal role in the metastasis and infiltration of
6、 cancer.【KEYWORD】Gastric cancer; Ornithine decarboxylase; Gene expression胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病是一个多层次、渐进的过程，但具体病因尚不十分清楚。鸟氨酸脱羧酶（ODC）是细胞内多胺代谢的关键酶，多胺是细胞增殖的重要调控因素。研究证实ODC与多种肿瘤的发生与发展有关1,2,3,4,5，为了进一步探讨ODC基因表达与胃癌的关系，我们采用了半定量RT-PCR和Western-blot方法对21例胃癌标本中ODC的 mRNA和蛋白质水平进行了检测，以为胃癌的基因诊断和治疗提供理论依据。1 材料与方法1.1材料1.
7、1.1标本的收集 2007年7月至2008年6月山东大学齐鲁医院普外科手术切除且经病理证实胃癌标本21例，其中高中分化10例，低分化11例。留取胃癌组织及距癌组织边缘58cm的胃正常粘膜组织，常规处理后液氮速冻，置于-80低温冰箱保存。1.1.2 试剂 Trizol试剂盒为日本Takara产品，反转录试剂盒为MBI FERMENTAS产品， ODC及-actin引物均为自行设计，由上海博亚公司设计合成，ODC引物：上游引物5-CCGTCTAGAATGAACAACTTTGGTAATGA-3,下游引物5-AGAAAGCTTCTACACATTAATACTAGCCG-3扩增片段为1386bp。-act
8、in引物：上游引物5-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3，下游引物5- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3，扩增片段为250bp。BCA assay reagent购自碧云天公司，鼠抗人ODC单克隆抗体购自Sigma公司，兔抗鼠多克隆抗体购自Dako公司，兔抗人-actin单克隆抗体、鼠抗兔-actin二抗均购自中山金桥公司。1.2 方法1.2.1 总RNA的提取 取100mg组织，参照TRIZOL（Takara公司）试剂提取说明书提取总RNA, UV2000紫外分光光度仪测260nm、280nm吸光度，检测RNA纯度并计算RNA含量，-80保存。1.2.
9、2 RT-PCR 取3g总RNA，参照FERMENTAS公司反转录试剂说明书用oliga dT合成cDNA。以cDNA为模板对ODC和-actin进行扩增，扩增体系为：50l 反应体系含5l 2mol/ L 的上游及下游引物,4l 25mmol/L Mg2+ ,3l 10mmol/ L dNTP ,1.25 U Taq DNA 聚合酶。945min预变性, 循环参数为94 40s ,56 40s ,72 1min共28个循环。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，结束后在含0.5g/lEB的染色液中进行染色。应用凝胶成像分析系统（AlphaImage2200）对条带进行半定量分析,ODC基因
10、的表达量通过扩增的-actin的表达进行校正,即以ODC/-actin比值作为ODC基因表达相对水平。然后计算癌组织和癌旁组织ODC基因mRNA表达量的比值( T/ NODC) 。1.2.3 总蛋白的提取 称取组织100mg，剪碎并匀浆，参照RIPA（碧云天公司）说明书向其中加入适量的裂解液，充分混匀后，在冰上静止10min，412000rpm离心10min，抽取上清。参照BCA试剂盒（碧云天公司）检测上清液中蛋白质的浓度。1.2.4 Western-Blot分析 取蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5min，在12%的SDS- PAGE胶中电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜上，转后的膜封闭于5%脱脂牛奶
11、的TBS液中(20mmol /L Tris-HCl，150mmol /L NaCl，pH7.5)室温60min。按比例加入对应一抗并在脱色摇床摇晃90min，4 孵育过夜，然后用TBST（在TBS中加入20的Tween）洗膜3次，每次10min，按比例配制相应的二抗并将膜在摇床上孵育60min，再用TBST洗膜3次，每次10min。ECL发光液孵育，暗室曝光。应用凝胶成像分析系统（AlphaImage2200）对条带进行半定量分析,ODC 基因的表达量通过扩增的-actin进行校正,即以ODC/-actin 比值作为ODC基因表达相对水平。计算癌组织和癌旁组织ODC基因mRNA表达量的比值(
12、T/ NODC) 。1.2.5 统计方法 结果以S表示，采用配对t检验和两个样本的t检验，使用SPSS软件进行计算。2 结果2.1 胃癌中ODC mRNA的表达 21例癌组织ODC mRNA表达量均高于相应癌旁组织（图1，2），统计学分析二者具有显著差异（P0.01），而且高中分化胃癌组织中ODC mRNA水平明显低于低分化胃癌组织（表1）。表1 胃癌中ODC mRNA的表达量标本nODC mRNA水平（S）癌旁组织癌组织高中分化低分化212110110.360.181.250.34*1.000.091.480.32*P0.01VS癌旁组织，*P0.01VS高中分化组-actinODC 1 2
13、 3 4 5 6 7图1 ODC mRNA表达量琼脂糖凝胶电泳图谱1 DNA标准分子量DL-2000(2000,1000,750,500,250,100) 2,4,6:癌组织 3,5,7:癌旁组织Fig1 AG electrophoresis of expression of ODC mRNA Lane 1: DL2000 marker; Lane 2,4,6: Tissue of gastric cancer; Lane 3,5,7: Adjacent tissue of corresponding gastric cancer图2 癌组织及相应癌旁组织ODC mRNA表达量的比较Fig2
14、Contrast of ODC mRNA between carcinoma tissue and adjacent tissue of corresponding carcinoma2.2 胃癌中ODC蛋白的表达 21例癌组织ODC蛋白表达量均高于相应癌旁组织（图3，4），统计学分析二者具有显著差异（P0.01），而且高中分化胃癌组织中ODC 蛋白水平明显低于低分化胃癌组织（表2）。表2 胃癌中ODC蛋白的表达量标本nODC水平（S）癌组织癌旁组织高中分化低分化212110111.690.45*0.910.351.310.352.040.15*P0.01VS癌旁组织 *P0.01VS高中分化
15、组ODC-actin1 2 3 4 5 6图3 ODC蛋白表达量Western-blot图谱1,3,5:癌旁组织；2,4,6:癌组织Fig3 Western-blot analysis of expression of ODC Lane1,3,5: Adjacent tissue of corresponding gastric cancer; Lane2,4,6: Tissue of gastric cancer图4 癌组织及相应癌旁组织ODC蛋白表达量的比较Fig4 Contrast of ODC between carcinoma tissue and adjacent tissue o
16、f corresponding carcinoma3 讨论多胺包括精脒、精胺和腐胺，是一类天然长链脂肪族化合物，含有多个氨基和亚胺基。它广泛存在于生物体内，具有稳定细胞膜结构，直接控制RNA和DNA的生物合成，影响基因的表达与调控等一系列的作用6,7。ODC的活性形式是由两个亚基组成的二聚体酶，是多胺合成途径中的限速酶，它的作用是催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺又可以顺序生成精脒和精胺。人基因组中包含两个ODC基因，其中一个位于7号染色体，另一个位于2号染色体短臂区，原癌基因N-myc与核糖核酸酶M2也位于该区域，N-myc基因的产物为核内的转录因子，核糖核酸酶是DNA合成中的关键酶。研究发现N-
17、myc和RRM2可与ODC基因共同扩增【8,9】。大量资料证实ODC在大肠癌、食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤中的活性都有升高。本实验室曾用酶学的方法测得大肠癌组织中ODC活性为同体癌旁组织的3.5倍左右【10】。本实验采用Western-blot的方法检测胃癌及其癌旁组织中ODC的表达量，结果显示胃癌组织中ODC蛋白含量为相应癌旁组织中的2倍左右，表明ODC蛋白含量增加与胃癌的发生相关。细胞内某种蛋白质的水平决定于蛋白质的生物合成速度与降解速度。为了判断胃癌组织中ODC蛋白含量的增加是否与合成速度有关，本文又通过半定量的RT-PCR方法检测了胃癌组织及其相应癌旁正常组织中ODC mRNA的含量，结果
18、显示癌组织中ODC mRNA含量显著高于癌旁组织，提示胃癌组织中ODC基因表达速度增强，蛋白质生物合成加快，导致ODC蛋白含量增加。本文还对不同病理分级的胃癌组织中ODC基因表达进行了分析，结果显示恶性程度越高的癌组织其ODC基因的表达水平就越高。上述研究结果表明ODC基因的表达增强与胃癌的发生发展密切相关。总之我们的研究结果表明ODC基因的过表达与胃癌的形成、发展以及恶性程度有关，提示ODC可作为胃癌基因诊断与基因治疗的靶分子，为进一步研究胃癌的基因诊断与基因治疗的方法提供了理论依据。参考文献：1 Subhi AL, Tang B, Balsara BR et al. Loss of met
19、hylthioadenosine phosphorylase and elevated ornithine decarboxylase is common in pancreatic cancer. Clin Cancer Res 2004; 10: 7290-72962 孙爱华，刘贤锡等.大肠癌鸟氨酸脱羧酶基因表达及临床意义研究J.中国现代普通外科进展，2004，7(3):1501513 Tian H, Liu X, Zhang B, et al. Adenovirus-mediated expression of both antisense ornithine decarboxylase
20、 and S-adenosylmethionine decarboxylase inhibits lung cancer cell growthJ. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2007,39(6):4234304 Deng W, Jiang X, Mei X, et al. Role of ornithine decarboxylase in breast cancerJ. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2008 ,40(3):235-243.5 Young L, Salomon R, Au W, et
21、 al. Ornithine decarboxylase (ODC) expression pattern in human prostate tissues and ODC transgenic mice. J Histochem Cytochem 2006; 54: 223-2296 Thomas T, Thomas TJ. Polyamine metabolism and cancerJ. Cell Mol Med. 2003; 7: 113-1267 Auvinen M, Paasinen A, Andersson LC, Holtta E. Ornithine decarboxyla
22、se activity is critical for cell transformation. Nature, 1992, 360: 355-3588 张璐. 鸟氨酸脱羧酶及其在肿瘤治疗中的应用J.国外医学临床生物化学与检验学分册, 1997,18(3):97999 Sistonen L, Holtta E, Lehvaslaiho H, et al. Activation of the neu tyrosine kinase induces the fos/jun transcription factor complex, the glucose transporter and ornithine decarboxylase. J Cell Biol 1989; 109: 1911-191910 刘贤锡,傅善基,赵春华,等. 大肠癌及癌旁组织中ODC活性及多胺含量研究 J. 中国肛肠病杂志,1996 ,16(4):11基金项目 山东省自然科学重大项目(z2004c01) ;教育部博士点自助课题基金资助课题(20040422029)作者简介 阎云飞（1982-），男，在读硕士，主要从事肿瘤分子生物学的研究。通讯作者 刘贤锡(1945 - ) ，男，博士生导师，主要从事肿瘤分子生物学的研究。E-mail :xianxisdu. edu. cn