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1、绪言,第一节 免疫学技术的范畴与应用,一、免疫学技术的范畴 二、免疫学技术的应用特点,免疫学技术的范畴,1、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定 2、对具有免疫活性物质的定性、定量测定（范围较广）,免疫学技术的应用特点,1、对象“包罗万象” 2、方法“兼容并蓄” （牵涉到物理，化学，生物，医学，计算机等各学科）,*如何学习和使用免疫学技术？ 基本原理的理解+说明书和手册（向仪器或试剂盒供应商索取或网上下载）,第二节 有关免疫学基本概念,一、抗原的概念与属性 二、免疫细胞的概念与分类 三、免疫应答的概念与过程,1、与抗体结合的物质 2、能够被免疫系统识别的物质 3、能够激活免疫细胞并与免疫效应
2、物起反应的物质,抗原,免疫原性可识别、可反应性 （诱导机体产生免疫应答的特性） 免疫反应性 选择结合性 （和免疫应答产物特异性结合的特性）,抗原的概念与属性,*抗原和半抗原,免疫细胞的概念与分类,免疫细胞（Immune cells） 泛指所有参与免疫应答及与免疫应答活动相关的细胞。 免疫活性细胞（Immune competent cell，ICC） 能够接受抗原刺激、产生特异性的活化、增殖、分化并形成效应产物的淋巴细胞。,免疫细胞的类型,红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞,免疫应答的概念与过程,免疫应答（immune response） 免疫系
3、统接触抗原后，免疫细胞对抗原进行识别；并使特异性淋巴细胞活化、增殖；表现出免疫效应的过程。 免疫应答的阶段 1、抗原识别阶段（antigen-recognizing phase） 2、淋巴细胞活化阶段（lymphocyte-activating phase） 3、抗原清除阶段（antigen-eliminating phase）,第三节 抗原抗体反应的基本原理,一、抗原抗体反应的原理 二、抗原抗体反应的特点 三、影响抗原抗体反应的因素,抗原抗体反应的原理,1、抗原抗体之间的作用力 2、抗原抗体结合物析出原因,参与抗原抗体相互作用的力,1、电荷引力（库仑引力） 2、分子力（Van der Waa
4、ls力，分子随机产生的电偶极矩极化而引起的相互作用 ） 3、氢键结合力（氢和电负性大的原子结合, 带正电的原子核暴露于外,可吸引其它电负性大的原子 ） 4、疏水作用力（由大分子中疏水基团相互接近. 而形成的一种作用力 ）,*以上作用力均非共价键,单独的抗原或抗体不自行聚合析出的原因,亲水胶体的形成 1、电荷排斥力（由蛋白质的等电点决定） 2、水化层的形成,抗原抗体的析出,抗原抗体的结合：可以导致 电荷的中和 水化层破坏 蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体，聚合析出,需要电解质的辅助,抗原抗体反应的特点,1、特异性 2、可逆性 3、适合比例性,特异性及其相对性,抗原A,抗原C,抗原B,特异性反应,交
5、叉反应,无反应,抗体,可逆性,K（亲和常数）=,Ag+Ab,Ag Ab,适合比例性,抗体含量,抗原含量,前带,后带,等价带,网格学说（lattice theory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,抗原抗体反应的影响因素,1、电解质 2、酸碱度（pH值6-8） 3、温度（37-42。C）,第四节 免疫学检测技术的评价,一、评价标准 二、特异性与敏感性的关系,评价标准,Specificity（特异）：检测信号针对性和排它性 Sensitivity（灵敏）：可测出的最低含量 Simplicity（简便）：操作是否方便 Safety（安全）：是否有污染，对操作者的伤害 Saving（节约）：性
6、能/价格比,特异性与敏感性的关系,灵敏度高、特异性低（假阳性） 特异性高、灵敏度低（假阴性）,抗原的提取与制备,第一节 抗原/免疫原制备的基本概念,一、抗原制备的目的 二、抗原的“纯度” 三、抗原制备的主要技术途径,抗原制备的目的,免疫原：激活T、B细胞 半抗原：检测相应抗体,抗原的“纯度”,免疫原：除保留可被B细胞识别的抗原决定簇，还需保留足够的被T细胞识别的抗原决定簇 半抗原：尽可能减少影响反应特异性的抗原决定簇,抗原制备的主要技术途径,天然抗原分离、纯化 半抗原人工合成、载体联接 抗原肽 合成、基因工程制备,第二节 完全抗原/免疫原的制备方法,一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备,
7、颗粒性抗原的制备,1、抗原的获取：采集分离 2、无害化处理：去除对机体有毒成分，如用甲醛,（细胞，细菌）,可溶性抗原的制备与纯化,1、处理与粉碎 2、蛋白质分离富集 3、单一组分提取 4、抗原纯度鉴定,（蛋白质、糖蛋白、脂蛋白）,处理与粉碎,组织粉碎： 机械 高速捣碎机 ，研磨 生物 酶消化（蛋白酶、胶原酶 ） 细胞破碎： 物理 反复冻融 ，冷热交替 ，超声 化学 表面活性剂 生物 溶酶，自溶,蛋白质分离,选择性沉淀： 盐析，有机溶剂沉淀， 水溶性非离子型聚合物沉淀（聚乙二醇） 透析技术：半透膜 超滤技术：负压+滤膜,单一组分提取的方法,层析技术：凝胶过滤 离子交换 亲和层析,凝胶层析（分子筛
8、）,离子交换层析,亲和层析,单一组分提取的方法（续）,离心技术：差速离心 密度梯度离心 电泳技术：电泳洗脱 等电聚焦,密度梯度离心法 控制溶液的比重，将不同比重的分子或细胞通过离心方法加以分离 分为： *不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法） *连续密度梯度离心法,不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法） 分离液仅形成单一的密度层，可在该层中获取与其比重一致的细胞或分子。 该法较多用于外周血单个核细胞的分离，常用的分离液为Ficoll。,聚蔗糖泛影葡胺,不连续密度梯度离心分离法,连续密度梯度离心法 分离液可形成一连续的密度梯度层，在不同的密度梯度层中可获取所需的不同种类的细胞。 该法可一
9、次分离得到几种所需的不同类型血细胞。常用于外周血细胞的分离，使用的分离液为Percoll。,聚乙烯吡咯烷酮,连续密度梯度离心分离法,单一组分提取的方法,电泳技术： 电泳洗脱：根据蛋白质的电荷和分子大小分离 等电聚焦：根据蛋白质的等电点分离,电泳技术(等电聚焦),抗原纯度鉴定,方法： 电泳法 免疫法 层析法 指标： 电泳纯（电泳法） 免疫纯（免疫扩散法，纯度要求高）,第三节 半抗原免疫原制备的方法,一、载体的选择 二、半抗原与载体的联接,载体的选择 结构复杂的大分子,蛋白质载体： BSA、HSA、OVA（卵清蛋白 ）、KLH（钥孔嘁血蓝蛋白 ） 聚合多肽载体：多聚赖氨酸 高分子聚合物载体：羧甲基
10、纤维素,半抗原与载体的联接,1、连接方式：物理法（吸附） 化学法 2、化学连接方法： 直接联接法：适用于带游离氨基或游离羧基的半抗原 间接联接法：适用于没有游离氨基或游离羧基的半抗原,半抗原与载体直接联接,碳化二亚胺法 蛋白质-COO + R-N+=CN-R H-N+-R 蛋白质-COO-C-NH-R + 半抗原-NH2 O 蛋白质-C-NH-半抗原 + R-NH-CO-NH R,半抗原与载体直接联接,戊二醛法 蛋白质- NH2 + 半抗原-NH2 + COH-（CH2 ） 3 - COH 蛋白质-N=CH-（CH2 ） 3 CH=N-半抗原,半抗原与载体直接联接,氯甲酸异丁酯法 半抗原-CO
11、OH + Cl-COO-CH2 CH（CH3）2 O O 半抗原-C-O-C-O-CH2CH（CH3）2 + 蛋白质- NH2 半抗原-CO- NH -蛋白质 + HO-CH2CH（CH3）2,半抗原与载体间接联接,琥珀酸酐法 O O 半抗原-CH2 OH + C-O-C CH3 CH3 O 半抗原-CH2 O-C-(CH2 ) 2-COOH,半抗原与载体间接联接,O-（羟甲基）羟胺法 半抗原-C=O +H2 N-O- CH2 - COOH 半抗原-C=N-O- CH2 - COOH,半抗原与载体间接联接,一氯醋酸钠法 半抗原- - OH + Cl- CH2 - COONa 半抗原- - CH2 - COOH,半抗原与载体间接联接,重氮化的对氨基苯甲酸法 HOOC- -NH2 + NaNO2 HOOC- -N=N 半抗原- - OH + HOOC- -N=N 半抗原- -N=N- -COOH OH,本章小结,1、免疫学技术的应用范畴 2、免疫学的基本概念 3、抗原抗体反应的原理、特点、影响因素 4、抗原制备的方法,思考题,1、免疫学技术的应用范畴有哪些？ 2、体外抗原抗体反应有哪些特点？ 3、可溶性抗原的制备涉及哪些技术？ 4、如何使半抗原具有免疫原性？举例说明 半抗原与载体的联接方法。,