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1、HSP27在糖尿病膀胱功能障碍中的作用及机制研究研究背景: 糖尿病膀胱功能障碍 (Diabetic Bladder Dysfunction,DBD) 是糖尿病(Diabetes MellitusQM)的一个常见并发症。又称糖尿病性膀胱病(Diabetic cystopathy,DCP), 发生机制目前认为与高血糖导致的膀胱逼尿肌功 能障碍和外周自主神经病变相关 , 且肌源性和神经源性两大因素协同发挥作用 , 最终通过膀胱兴奋性、顺应性、收缩性的改变导致DM膀胱功能受损。膀胱逼尿肌细胞的变化直接表达上述损伤改变。DM膀胱逼尿肌超微结构的改变,细胞相关收缩蛋白的结构受损是膀胱逼尿肌收缩功能障碍最主
2、要的结构基 础。因此如何有效保护逼尿肌结构、 促进其恢复具有重要的临床意义。 新研究提 示热休克蛋白 27(heat shock protein27,HSP27) 起稳定细胞骨架结构的作用 , 同 时发挥了重要的调节平滑肌收缩的作用。钙介质素(Caldesmon,Ca D)是一种细肌丝收缩相关蛋白,在调节平滑肌收缩 中起着非常重要的作用,而在DM表达增高。新近研究说明,HSP27的磷酸化能竞 争性抑制 Ca D 与原肌球蛋白 (Tropomyosin,TM) 的结合影响结肠平滑肌的收缩。我们课题组前期实验结果说明 HSP27在 DBD大鼠膀胱中表达下降,提示HSP27与 Ca D的相互作用可能
3、与DBD中膀胱收缩功能障碍发生有密切联系。如 果这一过程参与了 DBD膀胱收缩功能障碍的发病，那么调节HSP27的表达或磷酸 化水平,增加HSP27对Ca D调节作用,是否能对膀胱收缩功能有保护作用,其具体 机制是什么是本课题希望解决的问题。本课题对逼尿肌细胞中HSP27及 Ca D的研究有助于深入理解DBD勺发生机制、探索逼尿肌收缩功能障碍的保护措施和治疗靶点并为预后评估提供新的依据。DBD发病率高，临床疗效差。DBD是 DM的一个常见并发症,占DM患者的40%-100%即使在血糖控制稳定 的患者中,仍有25%勺DBD发病率。DBD起病隐匿,进展无病症,易被医患双方无视,最终出现包括慢性尿潴
4、留, 充盈性尿失禁 , 伴不可逆性或继发性尿路感染 , 反流性肾积水 , 肾功能损害等在内 的由于膀胱收缩功能障碍所引起的严重影响生活质量的并发症。DBD膀胱在超微结构常以逼尿肌的退化性改变为主要特征。肌丝滑行理论解释了肌收缩原理。 不同于骨骼肌 , 因为没有肌钙蛋白 , 平滑肌 的收缩需要更多的依赖类似于肌钙蛋白作用的细肌丝收缩相关蛋白来介导 , 从而 实现在缺乏肌钙蛋白和胞质 Ca2+变化的情况下，经由这些细肌丝收缩相关蛋白 介导以及这种介导上游的某种调控机制来共同完成平滑肌的收缩。DM中膀胱逼尿肌(detrusor smooth muscle,DSM) 的功能发生改变,这种改变 与其收缩
5、相关蛋白及上游调控机制的关系尚不清楚。HSP27作为一种重要的分子 伴侣,平滑肌组织在应激状态下HSP27的表达和活化状态可代偿性增加并有助于 维持和重建肌细胞的收缩功能。磷酸化后HSP27产生功能活性。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是 HSP27 磷酸化的上游信号通路。p-HSP27Ser15p-HSP27Ser78 和 p-HSP27Ser82 是热休克蛋白 27的 p38 MAPK 途径可激活的磷酸化位点,Ser15位于N,Ser78、Ser82位于C端。磷酸化的HSP27 可通过抑制丝状肌动蛋白 (F-Actin) 的解聚和促进球状肌动蛋白 (G-Actin)
6、的聚 合发挥稳定平滑肌细胞骨架和增强细胞收缩力的功能，但是HSP27对肌动蛋白的聚合和稳定作用机制目前尚不完全清楚HSP27在糖尿病膀胱平滑肌收缩功能中的作用亦尚未见报道。Ca D及TM为代表的细肌丝收缩相关蛋白 ,在调节平滑肌收缩中起着非常重要的作用。Ca D大小为-87KD,是一种细肌丝相关蛋白,能与Act in和TM结合，此时TM 位于 Actin 单体的外缘 , 封闭了 Actin 上的 myosin 的结合位点 , 阻碍 myosin 的头 部与Act in的结合,从而调节平滑肌的收缩。近期研究说明，在兔DBD模型中，膀 胱逼尿肌的Ca D TM等种细肌丝收缩相关蛋白的表达增高,膀胱
7、逼尿肌的收缩力 降低, 但其具体的调节机制不清楚。磷酸化HSP27可与Ca D结合，导致Ca D与TM的解离，从而暴露出Act in上 的 mysoin 的头部结合位点 ,myosin 与 Actin 的结合, 调节结肠平滑肌的收缩。 这 一作用及机制尚未在DBD中报道。我们前期实验结果说明在 DBD大鼠逼尿肌中HSP27勺表达下降,既往研究还 发现在兔的DBD模型膀胱逼尿肌细胞中Ca D、TM等细肌丝相关收缩蛋白表达升 高,但DM状态膀胱逼尿肌收缩的调节机制不清楚。我们推测 :DBD逼尿肌细胞结 构功能受损,Ca D等相关收缩蛋白表达增多，但HSP27表达下降,HSP27与Ca D 结合减少
8、,故而Ca D与TM的结合增多,TM圭寸闭Actin上的mysoin的头部结合位 点, 从而致膀胱逼尿肌处于舒张状态 , 逼尿肌收缩无力。本研究的主要策略：本工程拟选ZDF大鼠作为DM大鼠模型,并利用HSP27特 异性磷酸化抗体,检测DBD逼尿肌HSP27表达及磷酸化水平的改变；以及调节 HSP27磷酸化后离体逼尿肌条收缩相关功能的变化,初步验证HSP27寸DBD后逼 尿肌收缩功能的影响；为了明确HSP27勺表达及磷酸化与CaD TM等相关收缩蛋 白之间的相互作用在DBD的关系,我们通过调节体外培养逼尿肌细胞中 HSP27勺磷酸化水平改变基因转染后检测HSP27与 CaD TM的共表达变化；激
9、光共聚焦 检测磷酸化HSP27与Ca D等收缩相关蛋白的相互定位关系,探讨其在稳定肌动蛋白结构、调节平滑肌收缩中的作用机制。研究一调节HSP27磷酸化改变糖尿病大 鼠的膀胱收缩功能的研究目的 : 研究正常大鼠与 ZDF(zucker diabetic fatty) 糖 尿病大鼠膀胱收缩功能的差异 , 超微结构差异。方法：将2月龄ZDF雄性大鼠DM组(n=20)高糖高脂饲养，将2月龄SD雄性大 鼠对照组 (n=20) 正常饮食条件下饲养 ,16 周后检测大鼠的空腹血糖 , 行尿动力学 检测(膀胱剩余尿量、最大膀胱容量、最大膀胱压力);透射电镜检测DMfi与对照 组膀胱逼尿肌组织超微结构改变情况；
10、用HSP27磷酸化p38MAP途径的特异性抑 制剂和冲动剂 SB203580(C21H16FN3O和 Anisomysin(ab120495 C14H19NO预处 理肌条,分别检测HSP27去磷酸化或过磷酸化对肌条收缩力和收缩频率的影响。 结果:DM组膀胱收缩功能和逼尿肌牵张力低于 SD组大鼠,糖尿病大鼠膀胱逼尿肌 超微结构发生明显退行性变化。DM组牵张力显著低于SD组;HSP27磷酸化途径特异性的抑制剂SB203580刺 激肌条后DM组及SD组肌条牵张力降低;HSP27磷酸化途径特异性的冲动剂 Anisomysin刺激后DM组及SD组肌条收缩力升高。SD组抑制后牵张力与未经处 理DM组无显著
11、差异；DM组抑制后与未经处理DM组无显著差异；DM组冲动后牵张 力与未经处理SD组无显著差异。结论:1.DBD膀胱收缩力显著降低ZDF糖尿病雄性大鼠是理想的2型糖尿病 研究动物模型 , 血糖明显高于正常大鼠 , 膀胱逼尿肌最大排尿压力显著低于正常 大鼠。2.DBD膀胱结构退化用电子显微镜检测逼尿肌超微结构与对照相比，糖尿 病组ZDF大鼠的逼尿肌细胞肥厚、肿胀，细胞内肌丝减少和萎缩。3.DBD的逼尿肌牵张力明显低于正常组,趋势与膀胱排尿压一致。4.DBD中HSP27磷酸化起重要的调节作用：针对正常组,下调其HSP27勺磷酸化水平,牵张力可降低到与糖尿病组相近；针对糖尿病组,上调其HSP27勺磷酸
12、化水平,牵张力 可接近正常组；而下调其HSP27勺磷酸化水平,牵张力无更明显降低。研究二高糖对大鼠逼尿肌组织及细胞的HSP27及磷酸化水平Ca D、TM的表达影响及机制研究目的：研究糖尿病膀胱组织HSP27及其磷酸化位点Ser15、 Ser78、Ser82以及CaDTM的表达差异；不同浓度葡萄糖是否对逼尿肌细胞 HSP27 及磷酸化水平表达和相关收缩蛋白 Ca DTM的表达有影响;3 D-HSP27和3G-HSP27 经慢病毒转染逼尿肌细胞后是否对 HSP27及相关收缩蛋白Ca D、TM的表达有影 响。方法：利用免疫荧光染色,组织学检测DM组与对照组膀胱HSP27和Ca D TM 的表达与分布
13、情况；用QRT-PC和Western-blot的方法检测DM膀胱及对照组膀 胱中HSP27的转录和表达水平差异。利用特异性的磷酸化抗体标记检测 HSP27 Ser15 Ser78和Ser82的磷酸化 水平变化。用QRT-PCR口 Western-blot的方法检测DM膀胱及对照组膀胱中CaD TM等相关收缩蛋白的转录和表达水平差异。SD大鼠断颈处死，超净工作台内开腹，取出膀胱,去黏膜层并剪碎后移入10ml 0.1%胶原酶P消化液的离心管中，37 C孵育45min到1h,漂洗后细胞悬液重 悬于含10%FBS勺DME培养基中 ； 培养基 中正常葡萄糖浓度(5m M)为对照组，高葡 萄糖浓度(50m
14、 M)为干预组，通过免疫荧光染色和 westernblot检测48h后HSP27 在逼尿肌细胞表达和磷酸化水平，通过QRT-PC和 Western-blot的方法检测逼尿 肌细胞中Ca D TM的转录和表达水平差异。构建、纯化 LV5-3G-HSP27和 LV5-3D-HSP27过表达慢病毒包装，通过 LV5-3G-HSP27homo LV5-3D-HSP27homo 及LV5 NC阴性对照病慢毒载体系统转染逼尿肌细胞。细胞在静息状态或0.1u M乙酰胆碱刺激后，收集体外培养的逼尿肌细胞裂解后提取细胞蛋白,然后通过免疫共沉淀和免疫印迹技术分析磷酸化的HSP27与收缩相关蛋白Ca D、TM的结合
15、能力。将p EYFP-HSP27分别和p ECFP-Ca D p ECFP-TM勺质粒共转染膀胱逼尿肌细胞,培养48h后,激光共聚焦显微镜检测蛋白 共定位情况。结果：膀胱组织中HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表达下降,并且其三个磷酸化亚型Ser15、Ser78和Ser82均显著低于正常对照组；而Ca D和TM显著高 于正常对照组；高糖培养组的SD大鼠逼尿肌细胞数明显低于正常糖浓度。 逼尿肌 细胞培养中，QRT-PCR佥测高糖培养组Ca D和TM在逼尿肌细胞的表达高于正常 糖浓度组;免疫荧光检测HSP27在高糖培养组中表达下降,并且其三个磷酸化亚型Ser15、Ser78和Ser82均显著低于正常
16、对照组；Western blot检测高糖组下HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表达下降,并且其三个磷酸化亚型Ser15、Ser78 和Ser82均显著低于正常对照组，而Ca D和TM显著高于正常对照组。LV5-3D-HSP27过表达慢病毒转染体外培养的膀胱平滑肌细胞 ,HSP27与Ca D 共沉淀增加，LV5-3G-HSP27过表达慢病毒转染体外培养的膀胱平滑肌细 胞,HSP27与Ca D共沉淀减少,HSP27和TM共沉淀呈阴性；激光共聚焦下p EYFP-HSP2和p ECFP-CsD共转染组HSP27的分布与Ca D分布共定位非常接近，p EYFP-HSP2和 p ECFP-TM共转染组HSP
17、27的分布与TM分布无明显相关性。结 论:1.HSP27及其磷酸化水平在糖尿病膀胱组织和体外高糖培养的逼尿肌细胞中 表达、分布和转录水平降低,而CaD和TM平滑肌收缩相关蛋白表达和分布增高； 其中HSP27磷酸化水平的下调使逼尿肌细胞结构失去稳定性,是糖尿病膀胱收缩 功能降低的主要原因之一2.膀胱逼尿肌收缩机制之一可能为：磷酸化的HSP27增加了 CaD与其的结合,并使之发生结构变异，释放出TM,结合肌动蛋白产生收缩；而糖尿病状态下，低磷 酸化水平的HSP27吉合Ca D能力降低,Ca D与TM更多的绑定在一起，而TM无法 与肌动蛋白结合 , 使收缩力下降。 综上所述 , 我们在组织层面利用
18、2 型糖尿病 ZDF 雄性大鼠模型完成膀胱压力测试及对超微结构的观察,并揭示高糖中HSP27磷酸 化表达下降使逼尿肌的收缩结构和收缩功能活性下调可能是DBM发病机制。其中收缩力的下调可以通过HSP27磷酸化的抑制剂或冲动剂所改变。2型大 鼠模型中将DBD与 HSP27勺磷酸化及相关收缩蛋白对平滑肌收缩功能的调节联系 起来,来探寻DBD肌源性改变的趋势及其机制。在细胞层面研究高糖对大鼠膀胱逼尿肌相关收缩蛋白及磷酸化转录和表达的影响。并揭示高糖下调了 HSP27及其磷酸化水平,而上调了 CaD和TM的表达。在通过过磷酸化的HSP2经慢病毒转染逼尿肌细胞发现HSP27磷酸化激活了Ca D的磷酸化并与
19、之结合,使被Ca D绑定的TM释放而促进收缩的发生,从而解 释了糖尿病的氧化应激从上游下调了 HSP27磷酸化而上调了 Ca D,而Ca D的活 性也需要在磷酸化的HSP27激活下与HSP27吉合发生结构变异才能释放TM使肌 肉收缩。故可以作出以下推测：糖尿病导致HSP27和磷酸化的HSP27减少,这 种下调导致Ca D更多的与TM绑定而收缩功能下降；糖尿病导致氧化应激诱导了 更多的Ca D,而上调的Ca D因为缺乏磷酸化HSP27勺激活失去活性,导致其也绑 定了更多的TM;这是DBD中 HSP27参与调节的收缩功能降低的主要机制；(2)可能 TM活性也需要磷酸化HSP27来激活,糖尿病诱导TM表达增多同时因为降低的磷 酸化HSP27而减少了激活,也导致DBD中 TM不能结合肌动蛋白实现调节收缩的活性。综上,糖尿病状态下,因为高血糖的影响，HSP27、磷酸化HSP27以及逼尿肌细 肌丝收缩相关蛋白表达发生改变并均处于低活性状态 , 这使作用相当于骨骼肌中 肌钙蛋白的这组平滑肌肌丝运动相关蛋白对收缩的开关调节功能难以保持在正 常水平上。该推测揭示了 DBD发生的肌源性相关的分子病理生理学机制。