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1、基因工程克隆方案设计,基因工程实验设计,1、目的基因的序列分析 2、载体的选择和分析 3、克隆策略的设计 4、引物的设计,目的基因的序列分析,1、分析 ORF： 找到需要克隆的核酸序列 2、分析酶切位点： （1）酶切位点为0的酶；可通过引物加入，方便克隆； （2）酶切位点为1和2的酶：用于酶切克隆或基因和重组质粒的酶切分析。,载体的选择和分析,1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途。 2、MCS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有或1个的酶切位点) 3、表达载体，要注意表达框架配对。 4、载体的酶切位点，用于重组鉴定。,克隆策略的设计,1、平端克隆； 2、粘端克隆
2、（1） TA克隆 （2） 单酶切不定向克隆 （3）双酶切定向克隆,平端克隆,机械打断，化学合成，Eco R V酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow 酶补平，S1处理）产生平端； 克隆效率较低，ligase 要加大量； 载体需脱磷； 方向可正可反。,TA克隆,1、普通Taq酶扩增的PCR产物3末端会多加一个A; 2、公司提供的T-vector的5末端有一个粘性的T;,用途: (1)PCR产物快速克隆： （2）基因测序（可正可反）； （3）利用T-vector上的MCS, 为下一步克隆调整酶切位点,单酶切不定向克隆,载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）； 基因插入可正可反，需
3、要筛选。,双酶切定向克隆,类型： （1）粘-粘连接：最有效、最快捷 （2）粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平 特点: (1) 基因和载体都用两种酶切割； (2) 连接效率高； (3) 外源基因插入方向固定，不用鉴定。,定向克隆的注意点：,（1）两个同尾酶切出的末端一样，相当于单酶切不定向克隆； （2) 载体MCS中的两个酶切位点要远一点，防止一端没切透；（可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备）。,引物的设计,常规设计原则 特殊用途设计技巧,引物常规设计原则,1. 长度：7 nt, 一般nt左右; (仅binding , 不含接头) 2. G + C
4、含量 3. 避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构； 4. 引物自身不能互补（ 20nt Tm一般最佳 PCR反应中结合温度（anneaning temperature）T = Tm - 5,特殊用途引物设计技巧,1. 5附加酶切位点(定向克隆): 2. 引入点突变 3. 有不确定序列 4. PCR产物直接测序,5附加酶切位点(定向克隆),1、不同酶的保护碱基序列不同；NEB catalog提供相关资料。,2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序: Nde1 Eco R1,引入点突变,1. 一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.,2. 突变位点要靠近5端.,3.要注意密码子
5、的偏好性, 简并性,有不确定序列（34种）,5 ATG GGC ICC AIA ICT TCT ACC 3,说明：1、次黄嘌呤核苷酸I可与四种碱基配对； 2、可用于PCR产物直接测序。,有不确定序列（2种）,5 ATG GGC A CC ATA GCT TCT A(A/C)C 3,说明： 1,表示该位点有两种可能的序列A或C; 2. 合成引物时只要一条引物的money; 实际得到的是两条引物等比例的混合物： 5 ATG GGC A CC ATA GCT TCT AAC 3 5 ATG GGC A CC ATA GCT TCT ACC 3 3、设计时可靠近 3 端 4、不能用于PCR产物直接测序,