饮用水氯化消毒副产物及其遗传毒性.ppt

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1、饮用水氯化消毒副产物及其遗传毒性的检测,鲁文清 华中科技大学同济医学院公共卫生学院 劳动卫生与环境卫生学系,饮用水氯化消毒是应用最为广泛、控制介水传染病最有效的方法。1974年，Rook和Bellar等人发现饮用水加氯消毒会产生消毒副产物（disinfection by-products，DBPs），如三卤甲烷（trihalomethanes, THMs）、卤乙酸(HAAs)等。1976年，美国国立癌症研究所又报道，氯仿能引起雄性大鼠肾小管细胞腺癌和雄性小鼠的肝细胞癌。,一、氯化副产物的主要类别 二、饮用水氯化消毒的健康问题 三、氯化消毒剂的代用品 四、遗传毒性的类型及其检测方法 五、饮水氯化

2、副产物和氯化饮水提取物的遗传 毒性检测,一、氯化副产物的主要类别,（一）挥发性卤代有机物 （二）非挥发性卤代有机物,（一）挥发性卤代有机物 三卤甲烷：氯仿 一溴二氯甲烷 二溴一氯甲烷 溴仿 卤乙腈：二氯乙腈 溴代氯乙腈 卤代酮： 三氯乙酮,（二）非挥发性卤代有机物 卤乙酸：二氯乙酸 三氯乙酸 溴代氯乙酸 二溴乙酸 溴代二氯乙酸 卤代醛：二氯丙烯醛 卤代羟基呋喃酮： 3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氢)呋喃酮（MX）,1979年美国环保局在“饮用水安全法”中提出100g/L的三卤甲烷标准。1997年7月在正式提出的“消毒剂与消毒副产物法”第一阶段中，三卤甲烷标准降到80 g/L，另一类消毒

3、副产物一卤乙酸标准被定为60g/L 。 世界卫生组织在“饮用水卫生标准”中推荐氯仿在饮用水中的建议值为30 g/L。 我国目前只在“生活饮用水卫生标准(GB5749-85)”中规定三氯甲烷不得超过60g/L ，对其它消毒副产物未提出控制标准。,有机前体物：能与氯形成氯化副产物的有机物，主要是腐殖酸、富里酸、藻类及其代谢产物等。 水中氯化致突变物主要由氯与腐殖质反应生成。 2000年全国环境状况公布，城市居民日常生活排放的污水和很多工业废水都含有大量的溶解状有机物质 。,二、饮用水氯化消毒的健康问题,（一）氯化副产物与致突变性/遗传毒性 （二）氯化副产物与癌症 （三）氯化副产物对生长发育和生殖的

4、影响,（一）氯化副产物与致突变性/遗传毒性 氯化饮用水的有机浓集物在Ames试验中具有致突变性 氯化副产物-MX是Ames试验中致突变活性最强的化合物，MX在氯化饮水中的浓度处于ng/L水平，但它的诱变活性占了氯化饮水有机浓集物总诱变活性的15%-57%，是造成氯化饮水致突变的重要成分。,（二）氯化副产物与癌症,1. 动物试验 2. 流行病学研究,氯化副产物与癌：动物试验*,氯化副产物 / 作者（年代）受试动物结果 三卤甲烷 氯仿 国家肿瘤研究所（1976）小鼠肝肿瘤 国家肿瘤研究所（1975）大鼠肾肿瘤 Jorgenson (1985)大鼠肾肿瘤 一溴二氯甲烷 国家毒理项目（1987）大鼠结

5、肠和肾肿瘤 国家毒理项目（1987）小鼠肝和肾肿瘤 二溴一氯甲烷 国家毒理项目（1984）小鼠肝肿瘤 溴仿 国家毒理项目（1989）大鼠结肠肿瘤,氯化副产物与癌：动物试验*,氯化副产物 / 作者（年代） 受试动物结果 卤乙酸 二氯乙酸 Herren-Freund (1987), Bull (1990),小鼠肝肿瘤 DeAngelo (1991), Daniel (1982), Pereira (1996) DeAngelo (1996)大鼠肝肿瘤 三氯乙酸 Herren-Freund (1987), Bull (1990),小鼠肝肿瘤 Pereira (1996) 溴代二氯乙酸 Bull小鼠肝

6、和肺肿瘤 二溴乙酸 Bull小鼠肝肿瘤 So (1995)大鼠结肠肿瘤 溴代氯乙酸 Bull小鼠肝肿瘤,氯化副产物与癌：动物试验*,氯化副产物 / 作者（年代） 受试动物结果 卤乙腈 溴代卤乙腈 Bull (1985)小鼠皮肤癌 氯化羟基呋喃酮 3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氢)呋喃酮（MX) Komulainen （1997） 大鼠甲状腺、肾上腺、 肝脏、肺、胰腺、 乳房等部位肿瘤，淋巴瘤和白血病,暴露氯化副产物与结肠癌：流行病学调查*,作者（年代）暴露因子相对危险性调查结果癌症结局 HildesheimTHMs1.13(0.7-1.8)阳性（NS） 发病率 (1998) Marre

7、tt(1995) THMs1.5(1.0-2.2)阳性（NS） 发病率 Young(1987) THMs0.73(0.44-1.21)阴性（NS） 发病率 Zierler(1986)氯氯胺0.89(0.86-0.93)阴性死亡率 Cragle(1985)氯化水3.36(2.41-4.61) 阳性 发病率 Gottleb(1982)地面水地下水1.01阳性（NS）死亡率 Wilkins(1981)地面水井水0.89(0.57-1.43) 阴性（NS）死亡率 Brenniman(1980)氯化的地下水1.11阳性（NS）死亡率 Alvanja(1978)氯化水 1.61阳性 死亡率 NS：无统计学

8、差异,暴露氯化副产物与直肠癌：流行病学调查*,作者（年代）暴露因子相对危险性调查结果癌症结局 Hildesheim(1998) THMs1.7(1.1-2.6)阳性发病率 Marrett(1995) THMs0.99(0.5-1.4)阴性（NS）发病率 Zierler(1986)氯化水0.96(0.89-1.04)阴性（NS）死亡率 Gottleb(1982)地面水地下水1.79阳性发病率 Wilkins(1981)地面水井水1.42(0.7-3.16)阳性（NS）死亡率 Young(1981)氯1.39(0.67-2.86)阳性（NS）死亡率 Brenniman(1980)氯化的地下水1.2

9、2阳性（NS）死亡率 Alvanja(1978)氯化水 1.93阳性死亡率 NS：无统计学差异,暴露氯化副产物与膀胱癌：流行病学调查*,作者（年代）暴露因子相对危险性调查结果癌症结局 Cantor(1998) THMs1.5(0.9-2.6)阳性(NS）发病率 King(1996) THMs1.6(1.08-2.46)阳性发病率 McGeehin(1993) THMs 1.8(1.1-2.9)阳性发病率 Zierler(1988)氯氯胺1.4(1.2-2.1)阳性死亡率 Cantor(1987)氯化的地面水1.8阳性发病率 Gottleb(1982)地面水地下水1.2阳性(NS）死亡率 You

10、ng(1981)氯1.04(0.43-2.5阳性(NS）死亡率 Wilkins(1981)地面水井水2.2(0.71-9.39)阳性(NS）死亡率 Brenniman(1980)氯化的地下水0.98阴性(NS）死亡率 Alvanja(1978)氯化水 1.69阳性死亡率 NS：无统计学差异,（三）氯化副产物对生长发育和生殖的影响,1. 动物试验 2. 流行病学研究,氯化副产物与生长发育和生殖的作用：动物试验*,作者（年代）受试动物氯化副产物 结 果 Epstein (1992)大鼠二氯乙酸软组织缺损 Smith (1988)大鼠三氯乙腈软组织缺损 Smith (1989)大鼠三氯乙腈软组织缺损

11、 Smith (1988,1989)大鼠卤乙腈胚胎死亡 Toth (1992)大鼠二氯乙酸睾丸上皮细胞变性 Lander (1994)大鼠二溴乙酸睾丸上皮细胞变性 Cicmanec (1991)狗二氯乙酸睾丸上皮细胞变性,暴露氯化副产物与出生缺陷：流行病学调查 *,结局作者 暴露因子 相对危险性调查结果 畸形 Aschengrau(1993) 氧化的地面水1.5(0.7-2.1)阳性(NS) Bove(1992) THM 80g/L1.6(1.2-2.0)阳性 神经管缺损 Bove(1992) THM 80g/L3.0(1.3-6.6)阳性 口裂 Bove(1992) THM 100g/L3.

12、2(1.2-7.3)阳性 心脏缺损 Bove(1992) THM 80g/L1.8(1.0-3.3) 阳性(NS) NS：无统计学差异,暴露氯化副产物与生长发育：流行病学调查*,结局作者暴露因子 相对危险性调查结果 体重偏低 Kanitz(1996)二氧化氯 5.9(0.8-14.9)阳性(NS) 次氯酸钠 6.0(0.6-12.6)阳性(NS) 二氧化氯+次氯酸钠 6.6(0.9-14.6)阳性(NS) Savitz(1995)THM 83g/L 1.3(0.8-2.1)阳性(NS) Bove(1992)THM 80g/L 1.3(1.1-1.5)阳性 Kramer(1992)THMs 1.

13、3(0.8-2.2)阳性(NS) 生长迟缓 Bove(1995) THM 100g/ L 1.5(1.2-1.9)阳性 Kramer(1992)氯仿 10g/L 1.8(1.1-2.9)阴性 NS：无统计学差异,以上数据来自Mills 等人, Health risks of drinking water chlorination by-products: report of an Expert Working Group. Chronic Diseases in Canada. 1998, 19 (3).,三、氯化消毒剂的代用品,（一）氯胺 最常用的代用品。 消毒产生的THMs和致突变活性均较

14、氯消毒低得多。 本身具有致突变性，杀菌效果较差。 （二）二氧化氯 非常有效的消毒剂。 不产生THMs ，不使饮水的有机浓集物具致突变性。 成本较其它消毒方法高 ，应用技术较复杂。 （三）臭氧 不会产生THMs和卤代有机物。 出厂水无剩余臭氧，需用第二消毒剂。 费用相当昂贵,四、遗传毒性的类型及其检测方法,（一）遗传毒性和遗传毒物 （二）遗传学损伤的分类 （三）检测化学物遗传毒性的方法,（一）遗传毒性和遗传毒物,遗传毒性（genetic toxicity） 损伤DNA和改变DNA的能力,指遗传学的改变和损伤。 遗传毒物（genotoxic agents） 引起生物体发生突变的物质称为致突变物，因

15、其能损伤遗传物质，故又称为遗传毒物。,（二）遗传学损伤的分类,1. 从机理角度分为 以DNA为靶的损伤（包括基因突变和染色体结构畸变） 不以DNA为靶的损伤（染色体数目的异常，包括整倍体和非整倍体改变） 2. 从遗传学损伤能否被光学显微镜所见分为 细胞水平 分子水平 3. 从突变的角度分为 基因突变 染色体结构畸变 染色体数目的异常,基因突变： 基因内部DNA序列的改变 分为三种主要类型： 碱基对置换（base-pair substitution） 移码突变（frame-shift mutation） 三联体重复（triplet repeats）, 碱基对置换（base-pair substi

16、tution）,一种碱基被另一种碱基取代 转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的变化 颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的变化 点突变：单点突变，指一个碱基对发生改变 多点突变，指几个碱基对同时发生突变,移码突变（frame-shift mutation）,碱基插入（或缺失）突变，改变遗传阅读框。 移码突变造成遗传信息的严重错乱，不但可以改变基因表达产物蛋白质的氨基酸的组成，还可使蛋白质合成过早终止。严重的移码突变，常常引起细胞死亡。,三联体重复（triplet repeats）,特定的三联核甘酸被扩增，如CTG/CTG/CTG/CTG，重复数目超过正常 。 这种突变常与遗传疾病有关。,染色体畸变： 染色体

17、结构畸变（structural chromosome aberration） 由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失，或引起各种重排，从而出现的染色体结构异常。 染色体数目的异常 指染色体数目发生改变，又称染色体数目畸变或基因组突变（genomic mutation） 通常将引起染色体结构畸变的物质称为断裂剂，将引起染色体数目异常的物质称为非整倍体诱变剂,基因突变和染色体结构畸变是以DNA为 靶的损伤 染色体数目异常是不以DNA为靶的损伤,（三）检测化学物遗传毒性的方法,直接测试某种遗传学终点（基因突变、染色体畸变、非整倍体），以确定受试物是否有遗传毒性。 测定在遗传学终点前的通道

18、上发生的某一事件（如DNA损伤、DNA修复、姐妹染色单体交换等）来预测化学物是否具有损伤DNA的潜力。,常用方法：,1基因突变试验： 正向和回复突变试验： 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames Test） 哺乳动物细胞正向突变试验（hprt基因正向突变试验） 2染色体畸变试验： 体内和体外哺乳动物细胞微核试验 体内和体外哺乳动物细胞染色体分析 3DNA损伤试验： 哺乳动物细胞姐妹染色单体互换（sister chromatid exchange，SCE）试验 单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis，SCGE，慧星试验，comet assay）,五、饮水氯化

19、副产物和氯化饮水提取物的遗传毒性检测,（一）氯化饮水非挥发性有机提取物样品的制备 （二）饮水氯化副产物和氯化饮水提取物的遗传 毒性常用的检测方法 （三）结果评价,（一）氯化饮水非挥发性有机提取物样品的制备,水样采集，水样酸化，XAD2树脂吸附，丙酮洗脱，洗脱液浓缩至干燥，溶解于DMSO中，-20保存备用。,（二）饮水氯化副产物和氯化饮水提取物的遗传毒性常用的检测方法,1. Ames 试验（鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验）：是常用的经典方法 正向突变 野生型 突变型 回复突变 野生型：没有发生突变的有机体的正常性状。 正向突变：改变了野生型性状的突变。 回复突变：突变体所失去的野生型性状通过第二次突

20、变 而恢复。,2. 微核试验,微核是染色体或染色单体的无着丝点断片，一切进行分裂的细胞，在染色体断裂剂的作用下，均能产生微核。 （1）体内微核试验 小鼠骨髓嗜多染红细胞 （2）体外微核试验 人淋巴细胞 人肝肿瘤细胞（双核微核试验）,3.慧星试验（SCGE）,一种快速敏感的用于检测单个细胞DNA断裂和碱性不稳定损伤的技术。 广泛地运用于遗传毒理学、辐射生物学、肿瘤学、病理学以及环境与职业人群的生物检测。 该法具有灵敏、简便、快速、适用于体内、体外试验等优点，是检测遗传损伤的一种有效方法。,SCGE 的检测原理,当外来化合物导致DNA断裂时，经过实验中细胞原位裂解、 DNA 解链等过程后，电泳时，

21、损伤的 DNA 从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的 DNA 部分保持球形，二者共同形成“慧星”，慧星尾的长度和慧星尾中DNA的含量与DNA断裂成正比，以此可以定量分析单个细胞DNA断裂程度。,SCGE的体内、体外实验,体内试验： 动物染毒，取脏器制备成单细胞，制片，电泳， 观察DNA损伤。 体外试验： 使用原代细胞或建立的细胞株，染毒，细胞消化 后制备成单细胞，制片，电泳，观察DNA损伤。,SCGE测试步骤（pH 13）,组织细胞 单细胞悬液 微凝胶片 DNA解旋（pH13） 细胞裂解 电泳 （25V, 300mA, pH13） 中和，染色 图象分析,慧星分析,荧光显微镜+测

22、微尺 测尾长 荧光显微镜CCD成相分析系统 （IAS, Optilas comet system） Oliver 尾相（Oliver Tail Moment） 尾长（Tail Length） 头或尾DNA强度（head or tail intensity of DNA）,（三）结果评价,1. 阳性对照和阴性对照 阳性对照：已知的遗传毒物（诱变剂），包括需 活化和不需活化两种。 阴性对照：溶剂对照(常用DMSO) 空白对照 盲法观察：免除观察人员对观察值的主观影响。,2染毒浓度和时间 各剂量组的间距：1:2或1:3 最高剂量应当是受试物最大溶解度的剂量，或染毒途径许可的最大剂量。 染毒时间视受试

23、物特性而定。,3结果的重现性 重现性： 体外试验 - 在不同时间里，先后试验而获得的相同的结果（误差最好不超过10%）。 体内试验 - 应有足够的动物数量 结果的重现性是最好的判定阳性或阴性的证据！,4阳性结果的判断,在检出任一遗传学终点生物学试验中呈现阳性反应，有重现性，并有剂量反应关系。,A：阴性对照DMSO B：CDW 0.167 ml / ml culture C：CDW 1.67 ml / ml culture D：CDW 16.7 ml / ml culture E：CDW 167 ml / ml culture F： 阳性对照BaP 0.16 mM,对每一物质：在检测五种遗传学终点的一系列试验中均为阴性反应，可认为不具有诱变性。五种遗传学终点包括：DNA完整性改变、DNA重排或交换、DNA碱基序列改变、染色体完整性改变、染色体分离改变）。 对每一试验：阴性结果的判断应是各剂量组的观察值与阴性对照差异不显著。,5阴性结果的判断,谢 谢 ！,