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1、ABI3100简介 及 其常见问题解析,姜艳艳 2007.3.9,主要内容,ABI遗传分析仪简介 ABI3100相关简介 ABI 3100构造及毛细管工作原理 数据收集软件的简介 数据分析软件的简介 常见问题解析,一. ABI遗传分析仪系列 ABI测序仪和遗传分析仪系列： 377 DNA 测序仪,所采用的是板胶 最多可同时检测96个样品，要人工手动上样。 采用Genescan和Genotyper进行分析。,310遗传分析仪,采用一道的毛细管进行电泳。 一支注射器注胶 不能使用96孔板,使用48或96孔的模块，0.5ml的离心管上样。 所使用的软件及设置与377比较相像。,3100和 3100A
2、vant基因分析仪,3100为16道毛细管 3100Avant为4道毛细管 使用96孔板或384孔板进行电泳 使用注射器将胶注入毛细管，且有两支注射器,3130 和 3130 xl 基因分析仪,3130为四道， 3130 xl为16道。 从胶瓶中自动吸胶注入毛细管。 软件方面与3100基本相同。,3730 和 3730 xl 基因分析仪,3730为48道毛细管3730XL为96道毛细管的 其他与3130基本相同,主要性能参数：,二.ABI 3100构造及毛细管工作原理,1.结构图,250l,此图表示的是：气泡没有排出通道。,注意96孔板的使用。3100是16道的，每个run 使用两排孔。若是4
3、道的则是每个run 4孔，注意与样品名的对应。 310 是单道的毛细管，不能使用96孔板，而是使用0.5ml 的离心管上样。,阳极有电极插在buffer中,阴极没有电极，而是在毛细管外包裹着一层金属，插在buffer中。,与3100不同，310在毛细管旁边有一根金属电极插在buffer中。,2.毛细管工作原理 毛细管两端：,电渗流：pH大于6时，石英带负电荷，熔融的石英毛细管内层带负电，来自毛细管内的溶液的正电荷产生电渗流，沿负电荷的毛细管壁形成双层，在电场作用下，双层中的阳离子向阴极移动，带动可溶分子向同一方向移动。 为保证DNA片段分离的重复性，必须包埋毛细管内壁以除去电渗流，ABI310
4、0采用能进行DNA分离的POP-4或POP-6胶线性包埋毛细管内壁，阻止电渗流，使DNA从阴极到阳极没有液体的流动。毛细管的包埋使之随着时间而性能有所降低，影响使用寿命。,电泳：,检测： 一束激光被分成两束从毛细管的两侧同时照亮16根毛细管，当DNA片段经过检测室时，所带荧光染料被激发，荧光被检测到，形成胶图。,三.数据收集软件的简介 1.开关机器 顺序：电脑，3100机器，收集软件（关机相反）,2.空间校正 空间校正表明在CCD上呈现每一根毛细管发出荧光的正确位置，而不反应毛细管的任何信息。 更换毛细管，毛细管的被拆卸安装后时要进行空间校正。,3.光谱校正 是为了校正荧光染料发射光谱的重叠，
5、可以消除不同荧光染料间的相互影响。以下情况必需做校正：机器使用了新的dye set，激光器或CCD更换，结果不好有 pull up，pull down的峰。,进行光谱校正遵循以下步骤 新建Pvrotocol,新建plate,注意：进行光谱校正时应注意，4道的毛细管和16道甚至更多道的毛细管在检测灵敏度上明显不同，毛细管少灵敏度会明显高一些，这里忽略毛细管使用次数的影响。,校正不好的实例：,1. 软件提示： Insufficient number of dye spectra detected! Check raw data. 表现： （1）,实际原因：泳道没有收集到信号，即没有检测到目的峰，或
6、目的峰信号过低，低于750rfu。 解决方案：如有必要重新校正则减少与甲酰胺的比例，或增大进样时间。,（2）,实际原因：引物峰过高，检测范围包括引物峰部分。 解决方案：调整检测范围到引物峰之后，包括所有目的峰。,2. 软件提示：Saturated data detected. Calibration failed. 表现：,实际原因：气泡引起的峰使信号达到饱和，显示不通过。 解决方案：尽量保证胶及通道中没有气泡。 （下图是放大图）,3. 软件提示：Bad dye order detected. 表现：,实际原因：引物峰过高，检测范围包括引物峰部分。 解决方案：调整检测范围到引物峰之后，包括所有
7、目的峰。,4. 软件提示：Failed quality check: q=0.93807 is less than minQ threshold (0.95000) 表现：,实际原因：各颜色之间引起的put up 和put down 峰导致Q值低于设定值。 解决方案：权宜之计是降低Q值设定值，彻底解决就是重新生产matrix 。,4.检测样品 目前检测样品是marker0.2l ，上样量1.0l，总体积10l 样品的准备：甲酰胺与marker 混合均匀分装，加入样品后振荡， 离心，95变性5min，冰浴3min， 离心，上样。,5.结果的存储 先在“我的电脑”的E盘上建一个文件夹用于储存结果，
8、在数据收集软件中有 可以进行设定。,结果的重新导出： 结果可以重新导出，或将所需要的部分结果重新导出到指定文件夹。,6.手动控制,注意：手动控制oven时要“send”两次，一次设定温度一次打开oven。,四.数据分析软件的简介,应用GeneMapper进行数据的分析，下面进行简单的介绍。 1.Panel及bin的导入,2.分析数据 添加要分析的文件夹：,panel,Size standard,Analysis method,分析后如果如下图所示：不通过，查找原因。,查看原始数据：,查看内标：,结果所得图形：,分析工具栏：,常见问题的解析,1.所有毛细管没有数据 原因：毛细管或block通路中
9、有气泡 没有样品进入 自动进样器不在正确位置，使毛细管头吸入气泡或接触不到样品 措施：重新正确上样，排气泡，拆毛细管清洗block，syring，更换胶,2.个别毛细管无信号 原因：自动进样器不在正确位置（用20l 样品试验） 样品管是中空的（离心） 毛细管有弯曲或有损坏（更换毛细管）,3.信号过饱和 原因：上样量过大（稀释样品，减少进样时间）,4.信号过低 表现为信号很弱，内标只有几十rfu。 原因：甲酰胺质量不高 使用的水中盐离子浓度过高（更换超纯水） 没有足够的样品（增加上样量，校正自动进样器） 样品稀释倍数过大 混合的不充分（充分混合，离心） 自动进样器不在最佳位置,5. 基线不平，峰
10、形明显异常 原因：胶中可能有污染物（清洗block，syring，更换胶） 胶中有结晶或沉淀物（将胶在室温放置30min使之达到室温，旋 动使沉淀物溶解） 光谱校正的不好,6.信号凌乱，有倒峰 原因：所选的dye set不适合 光谱校正的不好,7.无电流或电流异常 原因：使用的水质量不好（更换超纯水） buffer槽中是水或 buffer稀释的倍数不对 阳极没有足够的buffer block或毛细管中有气泡（排气泡） 胶已失效 整个体系中有泄漏的地方,8. 小于100 runs毛细管检测结果不好 原因：样品本身不好 甲酰胺质量不好 buffer稀释的倍数不对 9. 检测的结果异常，移动的快或慢
11、 原因：注射器中有水导致胶被稀释 block或胶中有大气泡 整个体系中有泄漏的地方 甲酰胺的质量不好,10. 有一根毛细管电泳时背景有荧光，导致基线不平，影响结果。,原因：毛细管中有污染物，会随电泳次数增多逐渐消失。 处理办法：不加甲酰胺，每次加10l 的蒸馏水，电泳几次。,11. 每次电泳时并不是全部泳道信号都很好 信号弱或无信号的泳道主要集中在两端,解决方法：换成20l 体系试试，调整自动进样器尤其是Z轴。 连续多次上样看是否是某根固定毛细管，或者是毛细管有题。 或许与所用的96孔板有关，更换96孔板。,12. 泳道中间基线明显形成一个台阶,说明：属于正常现象。 可能是样品中有一些物质导致
12、的，与样品的纯度有关，但并不影响判型。 分析样品是会计算调整基线。,13. 电泳导致大片段峰形变宽,说明：属于正常现象，是电泳的一个特点。 与电泳时片段大小有关，随着时间的推移片段越来越大，所形成的峰变宽。,注：电泳时胶图,注：分析时图像,14. 电泳时易出现尖锐的四种颜色都有的峰（多显示为红色）,说明：胶中有气泡，离子，杂质颗粒或其他有机物不透光，发生全反射 导致的。 解决方案：灌胶前放置室内半小时平衡室温，离心，注意排净气泡，注 意环境的洁净程度，注意操作，以减少杂质进入。,15. 电泳时出现目的片断以外的其他杂峰,原因：主要原因是甲酰胺质量不好，或者是甲酰胺长期在4度放置有降解。 解决方
13、案： 更换质量好的甲酰胺。（确定不是扩增产物。）,16.出现电泳峰,说明：所出现的尖锐的小峰实际上是四种颜色都有的，位置不固定，杂乱无章，内标中相对明显，影响分析结果。当室温过高时明显会增多，可能是胶中有气泡，受热膨胀，易形成。严重影响分析结果的建议重新电泳。,16. 其他常见的电泳不好的现象,说明：内标峰值很低，样品峰值低不能作为扩增不好的依据。需要重新上样以 确定原因。,说明：内标并不均匀，大片段明显变低，可见是电泳结果不好，样品的峰 形不能作为扩增好坏的依据，需要重新上样来确定。,说明：可见所有峰的峰形异常，不能正确进行分型，是电泳异常的表现，需重 新上样。,说明：变性不完全现象。更换质
14、量好的甲酰胺，在上样前变性95C 3min,说明：如果校正时跑出如图的峰型，是电泳现象，与产品质量无关。更换质量好的甲酰胺，重新进行校正。,说明：上图现象是电泳中出现的现象，在校正正常且多数通过情况下，更换质量好的甲酰胺，上样前变性，重新电泳。与产品质量无关,总体说明： 检测结果不好时，对照现象查找原因，主要要注意： 使用超纯水 有足够的buffer，且稀释倍数正确 保证block通路中没有气泡，如需要请仪器负责人解决 加入适量样品如要加微量则有必要稀释，进样时间要适当，如不能更改则 调整上样量，使峰高在1000-3000 rfu 左右。 使用96孔板上样时如样品太多又复杂则应事先写好记录，加
15、样后振荡，离心 变性后立即冰浴3min 注意毛细管的使用次数（在instrument protocol处可见），注意毛细管不要 脱离buffer超过30min 如有离子影响结果，可用水上样试一次,其它注意事项： 16道毛细管每个run约用胶50l ，注意在整板上样时查看胶够不够。 做阳性对照和阴性对照。 如所提的DNA浓度大，做PCR时适量少加入模板，防止产物量过大影响电泳。 每个run加ladder用于分析时校正bin。 实验进行过程中不要一陈不变的遵循操作手册，而是要观察结果，调整内 标及ladder的使用量。（内标高度控制在200 rfu左右，ladder 控制在和内标相 当的高度）,谢谢大家,