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1、消化道共生菌对结肠炎症的影响实验背景：结直肠癌Colorectal Cancer,CRC是一种常见的恶性肿瘤性疾 病 , 也是一个由多因素引起和多阶段产生的病症。有关报道指出多种因素影响了 结肠癌的发生开展 ,例如遗传背景、环境因素、饮食习惯、精神压力和人口老龄 化等。最近研究发现 , 随着疾病的难以治愈和炎症的不断加重 , 发生结直肠癌的风 险也逐步提升。目前 , 人们对于结肠癌的作用机制和发病原因尚不清楚。在人类健康和疾病开展过程中 ,肠道菌群被认为是一种被遗忘的器官 ,它通 过各种复杂的机制维持着肠道平衡。最近有大量的研究报道说明 , 肠道微生物群 也可以作为一种在结肠癌发生和开展中起主
2、要作用的因素。许多学者根据高通量测序结果和动物模型构建提出了菌群在结直肠癌中发 挥的作用 , 但由于研究的局限性 , 只能初步了解肠道菌群的致病机制 , 也局限于肿 瘤在某个阶段或者某些致病菌对肿瘤的影响 , 但是肠道菌群在结肠中的动态变化 和具体机制仍待进一步探索。在这个微生物群时代 , 我们不仅要探索肠道菌群在 结直肠癌发生中的作用机制 , 还应着重强调其潜在的临床实践意义。如将根底实验研究结果转变成临床应用 , 将更好地表达肠道菌群在诊断和治 疗结直肠癌中的重要临床价值。 实验目的 ： 根据前期工作根底和文献报道 , 我们选 取了几种代表性的肠道菌：嗜酸乳杆菌pro15、肝螺旋杆菌514
3、48、具核梭杆菌 25586和产肠毒素脆弱拟杆菌 43860等, 通过实验探究 , 观测几种代表性肠道菌在 结肠炎向结肠癌转化过程中发挥的作用及其机制。实验方法： 1我们利用给小鼠腹腔注射 12.5 mg/kg 剂量的氧化偶氮甲烷 azoxymethane,AOM, 并且给小鼠饮用 2%葡聚糖硫酸钠 dextran sulfatesodium,DSS)水的联合诱导作用,建立了结肠癌的小鼠模型,这个模型可以很好的模拟溃疡性结肠炎( ulcerative colitis,UC )病人的结肠炎恶性转化为结肠癌 的过程。用肝螺旋杆菌51448和嗜酸乳杆菌pro15给C57/B6小鼠灌胃后,取结肠 固定
4、,利用HE染色和组化进行组织学观察，区分肿瘤的恶化程度及性质。(2) 利用LPS+D-GalN勾建小鼠急性肝功能损伤模型。腹腔注射LPS/GalN, 按照LPS:35卩L/kg,GalN:800卩g/kg,每只小鼠6卩L/g的剂量给药。(3) 用具核梭杆菌25586和产肠毒素脆弱拟杆菌43860给APC模型小鼠灌 胃后,取结肠固定，利用HE染色进行组织学观察，区分肿瘤的恶化程度及性质。酶 联免疫吸附实验(ELISA)检测白介素6 (IL-6 )、白介素17 (IL-17 )、丫干扰素(IFN- 丫)、白细胞介素-1 B( IL-1 B)、肿瘤坏死因子受体(TNF-a )等，分析 两种细菌对炎症
5、细胞因子的影响 ,从分子水平探究有关的作用机制。取小鼠肠系膜淋巴结，分别用抗小鼠的CD4 IFN- 丫、IL-17和FOXP3%体进 行外表marker染色和胞内因子染色，通过流式细胞技术检测不同组小鼠肠道内 促炎和抗炎反响水平。 取小鼠腹腔巨噬细胞分别与具核梭杆菌 25586和产肠毒素 脆弱拟杆菌43860的体外共培养实验，分别用62.5 X 106 cfu、31.3 x 106cfu、15.6 X 106 cfu、7.8 X 106 cfu、 0 cfu剂量的两种细菌刺激巨噬细胞 24小时后，收集细胞上清,ELISA检测TNF- a和IL-6水平。实验结果:(1)在结肠癌小鼠模型实验中 ,
6、肝螺旋杆菌 51448组和嗜酸乳杆 菌pro15组小鼠生存率均高于对照组，实验组和对照组相比在结肠长度并无差异 但是对照组小鼠肿瘤数量比实验组小鼠多。HE染色和组化结果显示实验组小鼠结肠内炎症细胞因子水平和对照组相比无显著差异2在小鼠急性肝损伤模型实验中 , 肝螺旋杆菌 51448 组小鼠生存率高于对照组。3具核梭杆菌 25586、产肠毒素脆弱拟杆菌 43860组与对照组相比 , 结 肠长度,瘤子数量没有明显差异，但是通过进行ELISA实验,发现25586组小鼠结 肠组织培养上清中的IL-17、IFN- 丫、IL-1 B、TNF-a和IL-6等炎性细胞因子 水平明显高于对照组 ,提示25586
7、介导了结肠的炎症反响 ,对结肠癌的开展有显 著的促进作用。43860细菌能够促进局部炎症细胞因子表达 , 有促进结肠癌开展的趋势。根据流式细胞仪分析结果显示，在CD4+v/supT细胞中，我们可以看出25586 组和43860组小鼠结肠内产生IFN- 丫和IL-17的水平比对照组显著增多，而 T-reg 阳性细胞的比例与对照组相比显著减少。根据体外共培养的ELISA结果可知,与不加细菌刺激的对照组相比,25586细 菌和43860细菌均能刺激巨噬细胞产生 TNF-a和IL-6,并且25586刺激巨噬细胞 产生炎性因子的能力更强。 实验结论:1肝螺旋杆菌 51448和嗜酸乳杆菌 pro15 对结肠癌的发生开展有一定的保护作用。但是可能不是主要通过抑制肠道炎症发挥作用。 251448能减轻LPS+D-GalN诱导的急性肝损伤模型的小鼠死亡率,推测其对肝脏损伤可能有一 定的保护作用。3具核梭杆菌 25586和产肠毒素脆弱拟杆菌 43860都能诱导肠道微环境 , 促进结肠癌的发生开展。