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1、实验七 土壤中细菌纯种分离和培养,一、目的要求,掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中初步分离培养细菌的方法，从而获得细菌纯培养技能；了解基本接种技术。,二、实验原理,土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌。,为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条
2、件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免菌源中各类微生物的相互干扰。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表所示。,三、仪器和材料,样品：新鲜土壤 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 无菌水：带有玻璃珠装有90mL无菌水三角瓶、 装有9mL无菌水的试管。 其它：无菌培养皿、无菌吸管、酒精灯、培养箱等 。,四、细菌纯种分离的操作方法,细菌纯种分离的方法有两种： 平板划线法和浇注平板法。,（一）平板划线分离法 1平板的制作 将融化并冷至约50的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。
3、每组制培养皿3套。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度。,用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（切勿划破培养基），划线完毕盖好皿盖，倒置，30培养24-48 h后观察结果。,2操作,划线的方式可取图中任何一种,1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,（二）浇注平板法,1采土样,选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤数10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。,2制备土壤稀释
4、液,将1瓶90mL和4管9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。称取土样10g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-1），在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。 注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管。,3平板的制作,取10套无菌培养皿编号，10-3、10-4、10-5各3个，另1个为空气对照。取1支lmL无菌移液管从浓度小的10-5菌液开始，以
5、10-5、10-4、10-3为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀）。,加热融化培养基，当培养基冷至45左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30培养24-48 h，然后观察结果。取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于30培养24-48h后观察结果。,土壤稀释液的制备和稀释液的取样,五、微生物的几种接种技术操作
6、,由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，现简介如下： （）接种用具 常用的接种用具有接种环、接种针、接种钩、玻璃刮刀、铲、移液管、滴管等。接种环和接种针等总长约25 cm，环、针、钩的长为4.5 cm，可用白金、电炉丝或镍丝制成。上述材料以白金丝最为理想，其优点是在火焰上灼烧红得快，离火焰后冷得快，不易氧化且无毒。但价格昂贵，一般用电炉丝和镍丝。接种环的柄为金属的，其后端套上绝热材料套。柄也可用玻璃捧制作。,（二）接种环境,微生物的分离培养、接种等操作需在经紫外线灯灭菌的无菌操作室、无菌操作箱或生物超净台等环境下进行。,（三）几种接种技术,1斜面
7、接种技术 是将长在斜面培养基（或平板培养基）上的微生物接到另一支斜面培养基上的方法。 （l）接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上。 （2）将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人等相关信息。 （3）点燃酒精灯。 （4）将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两支试管，中指位于两支试管之间，斜面向上，管口齐平。,（5）右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红以达到灭菌（环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧）。 （6）在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住棉塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉。将烧过的接
8、种环伸入菌种管内，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸入另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞并插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。,2液体培养基中的菌种被接入液体培养基,接种用具是无菌移液管和无菌滴管。移液管和滴管是玻璃制的，不能在火焰上烧，以免碰到水时玻璃破裂，需预先灭菌。用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。,3液体接种,是由斜面培养基接种到液体培养基中的方法。用接种环挑取斜面培养基上的菌种一环送入液体培养基中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入液体
9、培养基中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在液体培养基中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。,4穿刺接种,是将斜面菌种接种到半固体深层培养基的方法。 （1）如前斜面接种操作，用接种针（必须很挺直）挑取少量菌种。 （2）将带菌种的接种针刺入固体或半固体深层培养基中直到接近管底，然后沿穿刺线缓慢地抽出，塞上棉塞，烧红接种针，则接种完毕。,5.稀释平板涂布法,稀释平板涂布法与平板划线法、浇注平板法的作用一样，都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。此法接种量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置。,（1）稀释样品：方法与稀释平板法中的稀释方法和步骤一样。 （2）倒平板：将融化的并冷至50左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板。 （3）用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀。 （4）正摆在所需温度的恒温箱内培养，如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养。 （5）待长出菌落观察结果。,六、思 考 题,1分离环境中的细菌时为什么要稀释？ 2用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？,