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1、第二章 细胞分离与破碎 Cell separation and rupture,主讲人: 梁桂兆 Tel：13206183258 Email： 生物工程学院,生物分离过程的一般流程,一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中，这些产品主要为医药和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。,2.1 细胞分离,但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中
2、，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。,几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物,细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。,微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅
3、有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。,细胞结构,破碎细菌的主要阻力,破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键
4、的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,破碎酵母细胞壁的阻力,酵母细胞壁的结构示意图如图所示，细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,酵母细胞壁的结构示意图,M-甘露糖醇；P-磷酸二酯键; G-葡聚糖,红面包霉菌(Neurospora crassa)细胞壁结构示意图,红面包霉菌细
5、胞壁结构示意图,主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以-1,3糖苷键连接，某些以-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。 最外层(a)是-和-葡聚糖的混合物 第2层(b)是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来 第3层(c)主要是蛋白质 最内层(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。,植物细胞壁的化学组成和结构,对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。 次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。,植物细胞初生壁的化学组成,“经纬”模型,目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型
6、，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网络系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网络之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。,初生细胞的经纬模型,(a)切面观；(b)透视观；CM：纤维素的维纤丝；CW：细胞壁；E：伸展蛋白；ID：异二酪氨酸连键；PRO：原生质体,次生细胞壁,某些植物细胞，当
7、生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4m以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,细胞破碎技术,目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。,细胞破碎方法分类,细胞破碎机理图,机械法,机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 超声波破碎法（
8、ultrasonication）,操作原理,高压匀浆器 破碎原理： 物料的加工是在均质阀里进行的，物料在高压下进入调节间隙的阀件时，物料获得极高的流速（200300m/s），从而在均质阀里形成一个巨大的压力下跌，在空穴效应，撞击和剪切的多种作用下把原先比较粗糙的乳浊液或悬浮液加工成极细微分散、均匀、稳定的液液乳化物或液固分散物。,高压匀浆器,高压匀浆器,高压匀浆器（High pressure homogenizer）,高压匀浆法适用的范围,酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%(200g/L)左右。 团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。,高压匀浆法使用时注意
9、事项,高压匀浆器的操作温度上升约2-3/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。 多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。 操作方式：单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,影响破碎的主要因素,压力 温度 通过均浆器阀的次数,高压匀浆器破碎细胞,升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。
10、 在工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。,yno珠磨机,高速珠磨机（High speed bead mill） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 。,高速珠磨机工作原理,水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。在料液出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和
11、玻离小珠。,yno珠磨机,德国Netzsch公司生产的LM-20型珠磨机,园盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于径向，一种和轴倾斜，径向园盘使磨料沿径向运动，倾斜园盘则产生轴向运动。由于交错的运动，提高了破碎效率。除磨室有冷却夹套外，搅拌轴和园盘也可以冷却。,Netzsch LM-20型珠磨机,超声波破碎,超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种
12、型式，一般破碎效果后者比前者好。,超声波破碎的机理,一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation)，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,超声波破碎的适用范围,超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。 超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。,非机械法,酶解 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 化学法溶胞 其中酶法和化学法溶胞应用最广。,酶解(酶溶法Enymat
13、ic lysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。,真核细胞与原核细胞比较,酶解法的优点,发生酶解的条件温和； 能选择性地释放产物； 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等； 但酶水解价格高，故小规模应用较广；,自溶作用,自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，
14、大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。且改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。,渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。,冻结-融化法,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方
15、面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。,干燥法,经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。,化学法,采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质等从细胞内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等； 合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如Tr
16、iton X-100和吐温（Tween）等 ； 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 ；,化学法和酶法一样也存在对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。但该法容易引起活性物质失活破坏，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。,目标产物的选择性释放,破碎的目的是要得到一种或几种目标产物，因此，在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标产物、而使其它物质尽量少
17、地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，对下游的分离纯化操作的顺利实施是非常重要的。,利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释放出来。因此，选择发现地释放目标产物是可能的，关键是要知道目标产物的性质和存在的位置，选择适当的破碎方法和操作条件。,选择性释放目标产物的一般原则,仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围； 当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结融化法等。 当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法；,选择性溶解目标产物； 当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出； 另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度；,破碎技术的未来发展方向,多种破碎方法相结合； 与上游过程相结合； 与下游过程相结合；,思考题,1、细胞破碎的方法与种类； 2、目标产物释放原则；,Thank You !,End,