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1、血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,1,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,2,一、实验目的 了解电泳技术的一般原理 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,3,二、实验原理 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下,不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,即它们的电泳迁移率不同,因此可使它们分离 影响电泳迁移率的外界因素:电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 影响电泳迁移率的内在因素:质点所带净电荷的量、质点的大小和形状 按支持介质不同可将电泳分为纸电泳、醋
2、酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 另外,还可以按分离原理不同、支持介质形状不同、用途不同以及所用电压不同等将电泳分类 电泳的装置主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移;电泳槽可以分为水平式和垂直式两类,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,4,采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯,将它溶于有机溶剂(如:丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构,厚度约为120m,有很强的通透性,对分子移动阻力很小 醋酸纤维素
3、薄膜电泳是近年来推广的一种新技术,它具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖尾和吸附现象等优点 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物,分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同,在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物,正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳,染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快,其余依次为1-、2-、-及-球蛋白,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,5,三、实验器材 醋酸纤维薄膜(28 cm) 常压电泳仪 点样器(盖玻片) 培养皿 粗滤纸 载玻片 镊子,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,6
4、,四、实验材料与试剂 人血清(从血站购买) 巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.07) 染色液(氨基黑10B) 漂洗液,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,7,五、实验操作 浸泡:将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线,将之置于盛有缓冲液的平皿中,浸泡30 min方可用于点样 点样:用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液,然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)。在另一 载玻片上滴一滴血清,点样器(用盖玻片的一边)在血清上蘸一下(可来回移动一次),再将点样器轻印在加样线上,使血清渗透到薄膜内,形成均匀的直线,血清蛋白的醋
5、酸纤维薄膜电泳,8,电泳槽的准备:根据电泳槽膜支架的宽度,裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中,各倒入等体积的电泳缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上,即为滤纸桥 电泳:将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10 min。通电,调节电压至160 V,电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度,电泳时间约25 min 染色:电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液
6、的培养皿中浸泡5 min 漂洗:将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次,直至背景蓝色脱尽,条带清晰为止,可得到色带清晰的电泳图谱,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,9,六、注意事项 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液,其浓度为0.050.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快区带扩散变宽;缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中,不易分辨 点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免引起样品扩散。但不宜太干,否则样品不易进入膜内,造成点样起始点参差不起,影响分离效果 点样时,动作要轻、稳,用力不能太大,以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 电泳时应选择合适的电流强度,一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。电流强度高,则热效应高;电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散 操作过程为防止指纹污染,应戴手套,血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,10,七、实验思考 用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点? 电泳图谱清晰的关键是什么?如何正确操作?,