《方法学验证.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《方法学验证.ppt（56页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、中药质量标准分析方法验证 指导原则实施细则的介绍,国家药典委员会 钱忠直,中国药典2005版一部新增指导原则,中药质量标准分析方法验证指导原则 中药注射剂安全性检查法应用指导原则,中药分析方法验证实验项目,现行方法 回收率 精密度（仪器精密度） 重复性 专属性 线性关系和线性范围,2005版药典一部指导原则 准确性（回收率） 精密度 重复性 中间精密度 重现性 专属性 检测限 定量限 线性 范围 耐用性,与国际协调方法接轨（ICH） 规范中药分析方法验证的实验内容,中药方法学验证的特点,反映被测成分与辅料间的影响与试验操作误差 反映测定全过程误差的总和,特别包括其中提取、分离、转化反应等前处理
2、过程所带来的误差 由于中药所含成分复杂、含量偏低，试验步骤较多，测定难度会更大，对精密度等影响会更大，一般难以达到常见的如化学药品的要求，且随着含量的高低和分离步骤的多少，可达到的要求会不同。,验证的目的,证明采用的方法是否适合于相应的检测方法 新建立的检测方法、改变原检测方法、工艺变更、处方变更等均须验证 验证过程和结果均应记载在标准起草或修订说明中,需验证的分析方法类型,鉴别 限量检查 含量测定 溶出度、释放度 需控制的残留物、添加物等,需验证的分析方法类型,分析方法验证,项目 试验方法 数据要求,准确度(Accuracy),系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，有时也称真实度
3、，一般用回收率(%)表示。 以经典方法的测定值作为真值，建立方法的测定数据与之比较（该法适用于化学单体药物） 以加入对照品测定的回收率表示，一般有空白回收（制剂空白）和加样回收测定的方法（中药材、复方制剂等）,准确度(Accuracy),试验方法： 同一样品，制备相同浓度的6份样品（样品取样量减半，以1：1比例加入对照品） 同一样品，制备3个浓度的供试品，每个浓度分别制备3份供试液，对照品的加入有以下3种方式：,准确度(Accuracy),取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计 个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1：1比例加入，低、高浓度可选0.5：1、1.5：1的比例。加
4、入的对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。 取3个不同量的样品各3份，每个取样量分别按1：1比例加入对照品，中间浓度应选定在正常测定浓度，其他两个浓度可以结合范围考察的最高、最低点进行测定。 按标示量计算的组分，可参照化学药品测定方法，取9份样品，按0.8：1、1：1、1：1.2的比例加入对照品（样品取样量减半）。,准确度(Accuracy),报告的数据： 样品中待测成分含有量 对照品加入量 测定量 回收率计算值（%） 相对标准偏差（RSD%）,准确度(Accuracy),测定数据的精度要求： 一般应满足以下规定 回收率（%） 95105 相对标准偏差（RSD%）
5、TLCS5%，HPLC/GC3%,准确度(Accuracy),感冒清热颗粒中葛根素含量测定回收率1,准确度(Accuracy),感冒清热颗粒中葛根素含量测定回收率2,准确度(Accuracy),感冒清热颗粒中葛根素含量测定回收率3,3种回收率试验方法比较,精密度（Precision）,精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度(离散程度) 精密度可以从三个层次考虑： 重复性(Repeatability) 中间精密度(Intermediate precision) 重现性(Reproducibility) 精密度考察应使用均匀稳定的、可信的样品。如果得不
6、到，可用人为配制的样品进行研究。,重复性(Repeatability),重复性:在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度,重复性(Repeatability),实验要求： 在规定范围内，取同一浓度的样品，用6个测定结果进行评价； 或设3个不同浓度9份样品，用9个测定结果进行评价（高低浓度可以结合范围的考察设计，中间浓度为样品平均浓度，计算9份样品的相对标准偏差）,重复性(Repeatability),测定数据的精度要求： 一般应满足以下规定 相对标准偏差(RSD%)TLCS5%，HPLC/GC3%。,重复性(Repeatability),生丹颗粒中补骨脂素测定重
7、复性1,生丹颗粒中补骨脂素测定重复性2,生 丹 颗 粒 中 补 骨 脂 素 测 定 重 复 性 3,3种重复性试验方法比较,结果表明六份同浓度值与九份不同浓度值的相对偏差为1.11，九份不同浓度的RSD高于六份同浓度的RSD。,中间精密度(Intermediate precision),在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。 考察的目的：考察随机变动因素对精密度的影响 考察的变动因素: 不同时间 不同分析人员 不同设备 至少3人采用同一设备或同一人采用3台不同设备，对同一批样品测定含量。计算不同操作者或不同设备测定的含量平均值和相对标准偏差。
8、不能仅考察不同分析时间的结果，有重现性考察的，可以免做中间精密度。,重现性(Reproducibility),在不同实验室由不同分析人员、不同设备测定结果之间的精密度 考察的目的：当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验 目前阶段，该项试验可采用起草和复核试验的测定数据进行评价。但应由起草单位根据复核所的复核数据，报送两个实验室之间的相对标准偏差。 报告的数据：标准偏差、相对标准偏差或可信限 由于中药有些被测成分属于痕迹量的,因此两个或两个以上实验室测定结果的偏差允许范围目前尚难确定。,专属性（Specificity）,系指在一些可能存在的其他成分（包括杂质、降解物、基质等）存在时，采用
9、的方法能准确可靠测定出药材、饮片、提取物及中药制剂中被测成分的能力。 一种分析方法缺乏专属性时，可由其他辅助的分析方法作补充。,专属性（Specificity）,专属性有以下含义： 鉴别：确证被测物是否符合其特性。 检查：确保采用的分析方法可检出被测物中杂质或应控制物的准确含量，如有关物质、有毒成分、重金属、溶剂残留量等。 含量测定：提供样品中被测物含量的准确结果。,专属性（Specificity）,鉴别 应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均不得干扰测定 显微鉴别、色谱光谱鉴别等应附相应的代表性图象或图谱。,专属性（Specifi
10、city）,含量测定和限量检查 色谱法和其他分析方法，应附代表性图谱，以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方）试验说明方法的专属性。并标明相关成分在图中的位置，色谱法中的分离度应符合要求。必要时可采用二极管阵列检测或质谱检测进行验证,专属性（Specificity）,常用的试验方法: 空白阴性对照试验 比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱的一致性 色谱-质谱联用验证待测成分,空白阴性对照试验的试验要求 TLC：目测观察，空白阴性对照应不得显与供试品检测成分相应的斑点。 HPLC/GC/TLCS：空白阴性对照色谱中，在与相应对照品保留时间相应的位置应无色
11、谱峰或其峰面积小于5%,空白阴性对照试验 除去待测药味，按规定的制法制成空白样品，按测定方法同法制备空白阴性对照溶液 测定成分为2种以上药材含有的，应分别制备每一药味的空白，及减去含有共同成分药味制备的空白,检测限（Limit of Detection，LOD),检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。 试验方法： 直观法 仪器法（信噪比法）,检测限试验方法,采用已知浓度的对照品进行试验 直观法 如薄层色谱检测成分的检出量或毒性成分检出限量的确定。在薄层板上，以已知浓度的对照品点样，依法展开、显色后目测观察，可检出的最小量为检测限。 信噪比法 信噪比（S/N）为3：1的样品的浓度（或量）。
12、以已知浓度（或量）的对照品溶液进样，峰高值为3倍噪音时的对照品浓度为检测限。噪音的测量，可以空白溶剂进样，记录相应长度的色谱基线，测量相当于对照品保留时间前后适当距离的噪音高度即可。,定量限（Limit of Quantitative, LOQ）,定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 试验方法：一般以10倍于噪音的对照品溶液重复点样或进样5-6次，计算重复点样或进样的峰面积值的RSD%。当RSD%3%（薄层扫描法）或2%（高效液相色谱法/气相色谱法）的浓度（或量）为方法的定量限。若RSD%较大，应重新调整对照品溶液的浓度，进行测定。,线性（Line
13、arity）,线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。,试验方法,制备梯度浓度对照品溶液，以相同体积点样或进样测定峰面积值，制备标准曲线，并以峰面积值与对照品浓度（或量）作线性回归，计算线性方程和相关系数。 制备同一浓度的对照品溶液，以不同体积点样或进样测定，同法处理。 线性测定的浓度应尽量在一较宽的范围，至少应大于范围中的高低限浓度区间。 计算相关系数，要求： TLCS：R0.99，HPLC-UV：R0.999，HPLC-ELSD：R0.995。,范围（Range）,范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 考察的区间应尽
14、可能覆盖日后样品可能的含量范围 验证试验过程中除取样量和进样量可改变外，一般不得改动实验操作过程中规定的如溶剂体积、提取时间、萃取次数等。,范围（Range）,可结合准确度试验进行，并以高、低限浓度的精密度进行评价。 一般可在准确度试验的高低两个浓度点各加测3份样品，分别计算高、低浓度点6份样品的RSD%值，并满足以下规定TLCS法RSD% 5%，HPLC/GC法 RSD% 3%。,范围（单体药物）,范围（中药和复方制剂）,含量限度有上下限的，一般设定范围低限为含量限度下限的5070，范围的高限为含量限度上限的130150。 含量限度仅有低限的，一般设定范围为含量限度的5070至含量限度的25
15、倍以上。 以标示量规定含量限度的，可参照化学药， 一般设定范围为标示量的80120。,耐用性（Robustness）,耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据 开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明,耐用性（Robustness）,典型的变动因素 被测溶液的稳定性 样品提取方式 时间,典型的变动因素（液相色谱法）,不同品牌或不同批号的同类型色谱柱 （至少采用3根不同商品规格的色谱柱，测定同一批样品溶液的含量，计算含量值和RSD%。应提供不同柱分离的色谱图，计算理论板数、分离度和拖尾因子，并分别计算样品的含量
16、和柱间的相对标准偏差） 流动相的组成比例的变化 流动相pH值的变化 柱温 检测波长 样品溶液稳定性 （一般不得少于6小时，计算不同时间测定的峰面积平均值和RSD%，一般不得过2%）,典型的变动因素（气相色谱法）,不同品牌或批号的色谱柱 固定相 不同类型的担体 柱温，进样口和检测器温度等,典型的变动因素（薄层色谱法）,考察主要检测成分的分离情况 不同品牌的薄层板 点样方式 薄层展开时温度 （至少考察低温4-10和室温的分离情况） 薄层展开时相对湿度 （至少考察高湿75%相对湿度和低湿20%相对湿度的分离情况） 可根据实际情况增加考察项目,耐用性（Robustness）,经试验，应说明小的变动能否
17、通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效,耐用性试验示例,安宫将压丸中栀子苷测定提取条件选择,选择50ml甲醇超声提取,耐用性试验示例,安宫将压丸中栀子苷测定提取条件选择,选择50ml甲醇超声提取40分钟,耐用性试验示例,薄层鉴别 清咽润喉丸中玄参的鉴别湿度变化的影响,相对湿度58,相对湿度88,讨 论,参照国际通行方法，对中药质量标准的规范化研究提出了较为完善的要求，对药典标准、新药质量标准的起草、修订的工作有重要的指导作用。,讨 论,对分析方法验证的项目内容、实验方法和数据要求更为规范和严格。 收载了ICH分析方法验证的全部项目，有些内容能否适合中药的实际，还需经受实践的考验。,讨 论,评价方法结果的差异程度,所测成分的含量高低？,供试品的处理方法？,其他因素？,所测成分的理化性质？,