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1、附件植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS 2017071范围本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子 源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性 成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测 及鉴定。2原理提取试样中基因组 DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分。3试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB
2、6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为：核桃 5端弓I物：5-CGCGCAGAGAAAGCAGAG- 3核桃3端引物：5-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3核桃探针：5-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-33.2花生源性成分 Ara b2基因检测用引物（对）序列为：花生 5端引物：5-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3花生 3端引物:5 -CGCTGTGGTGCCCTAAGG- 3花生探针：5-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Ec
3、lipse-33.3杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为：杏仁 5端引物:5 -TTTGGTTGAAGGAGATGCTC- 3杏仁 3端引物:5 -TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG- 3杏仁探针：5 -FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse- 33.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物（对）序列为：芝麻 5端弓I物：5-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC- 3芝麻3端引物:5 -CTCGGAATTGGCATTGCTG- 3芝麻探针：5 -FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-33.5
4、榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为：榛子 5端引物:5 -CCCCGCTGTTTGTGATAT- 3榛子 3端引物:5 -ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3榛子探针：5 -FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse- 33.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为：大豆 5端弓I物:5 -GCCCTCTACTCCACCCCCA- 3大豆 3端引物：5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT- 3大豆探针：5-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-33.7真核生物18SrRNA内参照检
5、测用引物（对）序列为：内参照 5端引物：5 -TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA- 3内参照 3端引物：5 -AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT- 3内参照探针：5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-33.8 CTAB 缓冲液：55 mmol/L CTAB , 1400mmol/L NaCl , 20 mmol/L EDTA , 100 mmol/L Tris , 用10%盐酸调节pH至8.0, 121 C高压灭菌20 min,备用。3.9 蛋白酶 K: 20mg/mL。3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：
6、25:24:1 ）。3.11异丙醇。3.12 70% 乙醇。3.13 Taq DNA 聚合酶。3.14 dNTP混合液。3.15 TE 缓冲液（Tris-HCl、EDTA 缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl （ pH8.0）, 1 mmol/L EDTA （pH8.0 ）。3.16 10 PCR 缓冲液：200 mmol/L KCl , 15 mmol/L MgCl 2, 200 mmol/L Tris-HCl （pH8.8）。4仪器和设备4.1组织研磨器。4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。4.3恒温水浴锅。4.4离心机：离心力 12,000g。4.5 微量移液器(0.5 卩 L
7、10 ,10 卩 L100 卩,10 卩 L200 卩,100 卩 L1000 )。4.6实时荧光PCR仪。4.7涡旋振荡器。4.8天平：感量0.01g。5分析步骤 5.1试样总DNA的提取固体样品：将样品粉碎后称取0.30.6 g，按下列方法提取 DNA。也可用等效商品化 DNA提取试剂盒提取DNA。液体样品：取1 mL样品于Eppordof管中，加入1倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉 淀5 min，室温下以12,500 rpm离心5 min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提 取DNA。可按下列方法提取 DNA，也可用等效商品化 DNA提取试剂盒提取DNA。(1) 将处理后的样
8、品加入2 mL离心管中，加入600卩L CTAB缓冲液和40 蛋白酶K溶液， 振荡混匀，65 C孵育1 h (过夜孵育更好)，期间每隔10 min振荡混匀；(2) 加入500 的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1 ),振荡抽提10 min ,室温下以12,500 rpm 离心10 min;(3) 小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500 rpm离心10 min ;(4) 弃去上清液，用65C预热的TE缓冲液溶解DNA ;(5) 小心吸取上清，加入 200 氯仿：异戊醇(24:1)，振荡抽提，室温下以 12500 rpm 离心15 min;(6) 小心吸取上清液，加入等体积的异
9、丙醇，振荡均匀，12,500rpm离心10 min;(7) 弃去上清液，沉淀用 70%乙醇洗涤，离心1min，晾干，溶于50卩LTE缓冲液中。5.2 DNA浓度和纯度的测定取1卩L DNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD260/280值应在1.71.9之间时，适宜于 PCR扩增。5.3实时荧光PCR扩增反应体系总体积为25 L,其中10XPCR缓冲液5L,正反向引物(10卩mol/L)各1 L,探针 (10 卩 mol/L) 1L, dNTPs (10 卩 mol/L) 2 卩 L , Taq DNA 聚合酶(2.5U ) 0.2 讥，DNA 模板 (10-100ng/ yL)
10、2 L,用灭菌去离子水补足至总体积25真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。反应参数：50 C 2min ;95 C 15min;95 C 15s,60 C 1min ,40个循环。5.4实验对照检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。6结果判断与表述6.1质量控制以下条件有一条不满足时，结果视为无效：空白对照：无FAM荧光信号检出；(b) 阴性对照：无FAM荧光信号检出；(c) 阳性对照：有FAM荧
11、光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值w 35.0(d) 内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值v 30.0。 6.2结果判定(a) 如Ct值w 35.0则判定为被检样品阳性；(b) 如Ct值 40.0则判定为被检样品阴性；(c) 如35.0V Ct值v 40.0,则重复试验一次。 如再次扩增后Ct值仍为35.0 v Ct值v 40.0,则判 定被检样品可疑。6.3结果表述结果为阳性者，结合产品标识，表述为“检出XX源性成分”。结果为阴性者，结合产品标识，表述为“未检出XX源性成分”。结果为可疑者，结合产品标识，表述为“XX源性成分可疑”。7防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。本方法负责起草单位：河北省食品检验研究院。验证单位：中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食 品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术 中心、中国肉类食品综合研究中心。主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。