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1、课题3,酵母细胞的固定化,1,应用分析,一、课题背景,阅读课题背景并思考： 1、直接使用酶制剂在应用中各有什么优、缺点？如何解决使用酶制剂时的缺陷？ 2、固定化酶技术在应用中各有什么优、缺点？如何解决使用固定化酶技术在应用时的缺陷？ 3、固定化细胞在应用中各有什么优、缺点？,2,应用分析,1、直接使用酶制剂,天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶 剂等条件非常敏感，容易失活,溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本,反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用,（1）优点,（2）缺点,催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域,如何解决这些问题？,3,
2、应用分析,1、直接使用酶制剂,（3）解决方案,固定化酶技术,4,应用分析,2、固定化酶,（1）含义：,将酶固定在不溶于水的载体上。,（3）优点：,酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。,（4）缺点：,一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。,（5）解决方案：,固定化细胞技术,（2）实例：,利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。,5,应用分析,固定化酶的应用实例：生产高果糖浆,1、什么是高果糖浆？使用它有何好处？,高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿
3、和心血管病，对人的健康有利。,再思考：果糖属于什么糖?,果糖是一种：单糖 分子式：C6H12O6,6,应用分析,2、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？直接使用酶时有什么缺点？,生产高果糖浆需要： 作用： 特点： 直接使用酶时的缺点：,葡萄糖异构酶,酶稳定性好，可持续发挥作用,将葡萄糖转化为果糖,酶溶于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。,如何改进？,7,应用分析,3、改进：,固定化酶技术,4、具体做法：,5、优点：,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。 提高了果糖的产量和品质。,8,应用分析,3、固定化细胞,（1）含义：,将细胞固定在一定空间内的技术。,
4、（2）优点：,成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收,（3）缺点：,固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。,但相对较为完善。,9,应用分析,二、酶和细胞固定化方法(看课本P50）,思考：固定化酶或固定化细胞指什么？ 可以采取哪些方法进行固定？各有什么利弊？,1、固定化酶或固定化细胞：,指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。,2、方法：,10,应用分析,将酶（或细胞）包埋在细微网格里,将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。,将酶（或细胞）吸附在载体表面上,包埋法,
5、化学结合法,物理吸附法,固定化酶或固定化细胞采取的方法,11,应用分析,【比较】酶和细胞的固定方法和特点,酶分子很小， 容易从包埋材料中漏出。,细胞体积大， 难以被吸附或结合。,12,应用分析,思考1对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？ 思考2将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）。,吸附法。,13,应用分析,三、实验操作：包埋法固定细胞,明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。,1、包埋法固定细胞：,即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。,2、包埋时常用的载体包括：,14,应用分析,海藻酸钠： 一种天然多糖，是由海带中提取的天然多
6、糖碳水化合物，可作为食用的食品添加剂，也可作为支架材料用于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相容性使其适于作为释放或包埋药物。,15,应用分析,三、实验操作,（一）制备固定化酵母细胞,（二）用固定化酵母细胞发酵,16,应用分析,（一）制备固定化酵母细胞 1、酵母细胞的活化：,在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。,1g干酵母10mL蒸馏水50mL烧杯搅拌均匀放置1h，使之活化。,思考活化是指什么？,操作提示,酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。,17,应用分析,18,应用分
7、析,2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：,0.83gCaCl2150mL蒸馏水200mL烧杯溶解备用。,思考为什么要用蒸馏水，而不用自来水？,防止自来水中各种离子影响实验结果,操作提示,溶解物质要彻底。,19,应用分析,3、配制海藻酸钠溶液,0.7g海藻酸钠10mL水50mL烧杯酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸馏水定容到10mL。,加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止,思考为什么要用小火或间断加热，并不断搅拌？,防止海藻酸钠发生焦糊。,操作提示,20,应用分析,21,应用分析,4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合,将溶化好的海藻酸
8、钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中,以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌,思考为什么要将海藻酸钠冷却至室温？,海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。,操作提示,22,应用分析,23,应用分析,（5）固定化酵母细胞,以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。,思考 CaCl2溶液有什么作用？,使胶体聚沉，形成结构稳定的凝胶珠。刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。,操作提示,滴加注射器中的溶液时，速度一定要恒定且缓慢，以便形成
9、的凝胶珠呈均匀的圆形或椭圆形。,24,应用分析,25,应用分析,26,应用分析,（二）用固定化酵母细胞发酵,将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次。,将150ml质量分数为10的葡萄糖溶液转移至200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25C下发酵24h,思考 1、为什么要用蒸馏水冲洗凝胶珠？,洗去凝胶珠表面多余的CaCl2溶液。以免对实验造成影响。,思考 2、葡萄糖在这里有什么用？,既可以作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的营养物质。,27,应用分析,28,应用分析,1、海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。 如果海藻酸钠浓度过高：,四、特别注意：,将很难形成凝胶珠。高浓度海藻酸钠
10、只能用粗针头注射，针头粗也会粘着，难促使形成液滴。且高浓度海藻酸钠不易形成滴状下落，形成条状，不是圆形或是椭圆形，品相极差，并且凝胶珠容易破裂。,形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。因为包埋不紧密，细胞容易从包埋材料中漏出。且形成的凝胶珠可能带细丝尾巴。,如果浓度过低：,29,应用分析,刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。 二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的,2、酵母细胞的固定化,30,应用分析,（一）观察凝胶珠的颜色和形状,五、结果分析与评价,（二）观察发酵的葡萄糖溶液,如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色：,说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；,如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：,说明海藻酸钠的浓度偏高。,二者都说明制作失败，需要再作尝试。,利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味,31,应用分析,思考 1、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？,酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。,思考 2、锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？,酵母菌进行无氧呼吸产生的,32,应用分析,本节结束,并做好复习！ 请完成习题,33,应用分析,