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1、大鼠继发性脑室出血损伤机制及辛伐他汀干预研究脑室出血 (intraventricular hemorrhage,IVH) 是指脑室系统周围或脑室内 出血, 常继发于物理性脑创伤、高血压脑出血和动脉瘤破裂蛛网膜下腔出血等疾 病。IVH是脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)患者的最常见同时也是最严 重并发症之一 , 与 ICH 患者高死亡率和高致残率密切相关 , 严重危害着公众健康。既往研究报道,约40%勺成人自发性ICH患者会合并IVH的出现,这局部病人 罹患脑积水的几率高达 51%-89%。新近临床研究已经证实 ,IVH 及其诱发的继发性 脑积水是导致ICH患者预
2、后的两项独立危险因素，因此，如何缓解IVH后脑积水已 经逐渐成为 ICH 救治的重要干预靶点。然而，既往IVH动物模型仅仅展示出了原发性IVH的特点，而临床IVH绝大多 数为继发性 , 尤其是继发于脑出血破入脑室形成脑室积血。一些回忆性临床分析 提示, 继发性 IVH 出现远期分流依赖的脑积水的几率要明显高于原发性 IVH, 但这 一临床现象尚未得到证实。基于此,课题组在国际上首次建立了继发性IVH(脑出血破入脑室)大鼠模型,并对模型的可靠性、稳定性和可重复性进行了评价 ; 此外, 我们还比拟了继发性 IVH 大鼠模型和原发性 IVH 大鼠模型脑损伤和脑积水发生情况 , 进一步验证上述 临床现
3、象。越来越多的研究证据指出血液的分解代谢产物 - 铁离子可能是导致出 血后脑积水和脑损伤的关键因素。据此我们推测 :ICH 破入脑室会引起脑 - 脑脊液屏障结构完整性破坏 , 脑实质 内的血肿可能成为持续的铁离子来源 , 通过屏障缺口不断的浸入到脑室系统 , 造 成脑实质和脑脊液铁离子蓄积 , 最终加重脑积水和脑损伤。他汀类药物 , 即 3- 羟 基-3- 甲基戊二酸辅酶 A(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-Co A) 复原酶抑制剂 , 是广泛使用的降脂药物 , 临床上主要用于心脑血管疾病的一级和 二级预防。大量研究报道 , 他汀类药物除了具
4、有较好的降低胆固醇的成效 , 还发挥了保护BBB免疫调节、抗氧化和促血管再生等多种中枢神经保护多效性。近年来 ， 几项大型回忆性队列研究结果显示：他汀类药物的使用能够有效地减少ICH患者 死亡率,改善远期预后 ,可能具有良好的临床应用前景。然而, 国际上尚无权威的随机、对照临床试验验证上述成效 , 尤其是在 ICH 合并 IVH 的患者中。辛伐他汀作为一种发酵来源的天然他汀类药物 , 具有高度的 亲脂性和血脑屏障透过性。新近研究提示辛伐他汀可能有促进血肿吸收的成效。但相关的机制不清 , 辛 伐他汀对继发性 IVH 的潜在治疗效果有待进一步的观察。因此,基于上述发现,我们推测：辛伐他汀有望通过加
5、速脑内血肿去除缓解继 发性 IVH 后脑损伤。综上 , 本研究主要从以下三局部实验内容进行展开 ： 首先, 建 立并评估继发性IVH大鼠模型的稳定性、可靠性和可重复性。其次, 将原发性 IVH 大鼠模型与继发性 IVH 大鼠模型进行比拟 , 观察继发性IVH 是否会出现更为严重的脑损伤和脑积水 , 以验证上述临床观点 ; 同时进一步探讨脑内血肿在继发性IVH后脑积水发生开展中的作用。最后，验证早期系统性 辛伐他汀治疗能否加速脑内血肿去除缓解继发性 IVH后脑积水，改善神经功能障 碍。一、大鼠继发性脑室出血新模型的建立和评估目的自发性脑出血合并脑室出 血是一种严重的临床疾病 ,但缺乏相应的研究。
6、 到目前为止,尚无满意、 有效的动 物模型能够模拟脑出血合并脑室出血的临床特点。鉴于此, 本实验拟建立实验性脑出血合并脑室出血大鼠模型 , 同时对出血后 脑积水以及血肿周围组织损伤进行检测以评估模型的稳定性和可靠性。 方法在课题组前期建立的IVH大鼠实验模型根底上，通过调整血液注射坐标，利用立体定 位仪将200卩l自体血缓慢注入大鼠右侧纹状体区坐标为：前囟后0.2mm,旁开 2.2mm,深 5.0mm。24h后,采用组织形态学等方法检测血肿及血肿周围组织损伤。损伤后第4周,利用小动物MRI观察脑室扩张情况、脑组织丧失情况、海马体积大小以及大 脑皮层厚度；通过Morris水迷宫实验评价大鼠神经认
7、知功能。结果 1. 自体血纹状体注射后 , 大鼠形成了稳定可重复的脑内血肿和脑室扩张, 较好的模拟了 ICH 合并破入脑室患者的临床特点 ；2. 模型大鼠在表现出了急性期的脑水肿、BBB破坏和典型的血肿周围脑组织损伤的病理特征；3.术后第4 周时,T2WI扫描观察到了显著的脑积水和脑组织丧失，Morris水迷宫测试揭示了 大鼠出现了严重的学习、记忆功能障碍。结论该模型成功地再现了ICH合并IVH患者的临床病理生理特点 ,可用于对出血后慢性脑积水及血肿周围脑组织损伤发 生的病理生理机制的进一步探索。二、大鼠继发性与原发性脑室出血模型脑损伤比拟及机制研究目的有研究报道称, 脑出血合并脑室出血的患者
8、发生脑积水的几率较高 , 会进一步加重脑出血 患者的不良预后。 但是, 介导上述临床现象的对应机制仍然没有得到合理的解答。鉴于此, 本实验拟通过在体动物实验探讨继发性脑室出血后脑积水发生开展 机理,初步说明上述临床现象的潜在机制。方法本局部实验首先通过自体血注射 法建立了脑出血合并脑室出血大鼠模型和原发性脑室出血大鼠模型两种实验性 脑室出血动物模型然后, 分别采用了小动物磁共振扫描成像、 Morris 水迷宫实验、脑含水量检 测、伊文思蓝渗出检测、免疫组化染色、免疫蛋白印迹、铁离子定量检测和电镜 等技术和手段对两组模型大鼠进行了评价和比拟。 最后, 通过给予去铁敏 一种铁 螯合剂 治疗初步说明
9、铁离子在继发性脑室出血后脑积水发生中的作用。结果 1.尽管两组脑室出血模型接受了同等剂量的脑组织血液注射 , 与原发 性脑室出血组相比 , 继发性脑室出血大鼠出现了更为严重的脑室扩张、室管膜纤 毛损伤和铁超载 , 以及更加异常的急性脑损伤和神经功能障碍 ;2. 系统性去铁敏 治疗更加显著、 有效地缓解了继发性脑室出血组大鼠所并发的脑积水。 结论我们 的研究结果提示 ,继发性的脑室出血比原发性的脑室出血损伤更严重, 主要表现为更加典型的慢性脑积水和脑铁超载。脑内血肿可能通过加剧铁离子持续性的蓄积影响了继发性脑室出血后慢性 脑积水的进展。 三、辛伐他汀对大鼠继发性脑室出血后脑损伤的干预效应和机制
10、研究目的我们在第二局部研究中发现了 , 脑内血肿通过加剧铁超载诱发室管膜纤 毛损害, 进而加重脑室出血脑积水。因此,我们推测: 加速脑内血肿自吸收可能成为治疗脑室出血的研究新靶点。 新近文献提示 , 辛伐他汀可能具有加速血肿吸收的成效 , 因此, 本实验拟观察辛伐 他汀对脑室出血大鼠的治疗效果。方法采用自体血注射法建立脑出血合并脑室出血SD大鼠实验模型。模型动物在术后第 1d 随机接受辛伐他汀或溶剂治疗 , 然后连续给药 1 周。利用小动物磁共振成像技术于术后 1天、3天、7天、14天和 28天动态观 察并计算大鼠侧脑室体积。期间 , 在术后 1-7 天和术后 23-28 天分别进行大鼠运 动
11、功能和神经认知功能的评估。然后剥离脑组织样本 , 先后进行铁沉积检测、铁相关蛋白检测以及室管膜损 伤检测等。最后 , 在脑室出血接受连续 3d 的辛伐他汀治疗后 , 采用免疫蛋白印迹 和免疫荧光技术检测清道夫受体 CD36能够加速细胞吞噬在脑组织中的表达与 分布; 同时, 采用荧光素标记红细胞脑内注射模拟脑出血 ,分别给予生理盐水、辛 伐他汀、辛伐他汀+CD3沖和抗体治疗,3d后采用免疫荧光双标技术观察和分析 小胶质细胞对红细胞的吞噬情况。结果1.辛伐他汀显著升高了血肿吸收速度 ,减小了脑室体积 ,并有效缓解了 脑室出血大鼠的神经功能障碍 ;2. 与对照组相比 , 辛伐他汀组大鼠脑铁蓄积更轻、 室管膜纤毛存活率更高；3.辛伐他汀治疗后上调了血肿周围小胶质细胞 CD36表 达, 并促进了小胶质细胞对红细胞的吞噬。结论辛伐他汀有效增强了脑室出血后 脑内血肿的吸收 ,缓解了脑积水 ,同时促进了大鼠神经功能修复 ;其可能机制是通 过上调小胶质细胞CD36加速红细胞吞噬实现。上述的研究结果提示 ,住院早期服用辛伐他汀有望成为脑室出血患者治疗的新方法。