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1、多糖中CTAB含量的测定方法【说明书】：技术领域本创造涉及测试分析领域，具体地涉及一种利用高校液相色谱测定脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的方法。背景技术CTAB全称为十六烷基三甲基溴化铵，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在多糖纯化过程中，CTAB乍为螯合剂使复合糖得以沉淀。然而CTAB具有一定的刺激性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而使人体受到危害。近年来，在生物制品申报过程中，国家规定应明确CTAB等有机物质残留量以降低制品风险。因此准确测定脑膜炎多糖原液中CTAB的残留量对疫苗生产有着重要影响，对疫苗产品质量控制具有重要的意义。目前，国内外尚无文献报道脑膜炎球菌多糖原液及脑膜炎球
2、菌多糖疫苗中CTAB残留量的测定方法，因此如何对脑膜炎球菌多糖疫苗中的CTAB进行检测尚不确定。创造内容本创造目的是提供一种快速而准确的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法。为实现本创造目的，提供的测定方法包括以下步骤：取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中 CTAB勺浓度。具体地，包括以下步骤：1制取CTAB标准溶液作为样1,其浓度标记为C1; 2取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为 样2; 3样1、样2分别上样于高效凝胶色谱柱；4记录色谱图并进行积分计算；5根据公式 计算样2中CTAB的浓度。其中，凝胶色谱柱为 TSK
3、gel G5000色谱柱。其原理是根据样品分子大小不同进行别离，CTAB与肺炎多糖分子大小间存在差异，可被有效别离。其中，流动相为NaCl溶液。其中，上样体积分别为 20-100卩1 ；洗脱流速为。其中，在检测波长为 214n m下记录色谱图。其中，所述脑膜炎球菌为A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌 中的任意一种。其中，根据色谱图进行积分计算，利用以下公式计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度：将CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1;将待检的脑膜炎球菌多糖溶液样品，作为样 2;根据公式I计算样 2中CTAB的浓度：C2=S2-S1X C1,其中， S
4、2为样2对应的峰面积，S1为样1对应的峰面积；根据公式H计算样 2中CTAB的百分含量：F= C古C0 X 100%其中，CO为待检脑膜炎球菌多糖溶液样品中的多糖浓度。在本创造优选的实施方案中，检测脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的具体步骤为：1精密制取CTAB标准溶液作为样1,其浓度标记为C1；2取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为样 2 ；3 充分平衡色谱柱后，将样 1上样于凝胶色谱柱进行洗脱，记录色谱图：洗脱峰开始所对应时 间标记为t1，洗脱峰结束所对应时间标记为t2 ；4 对样1色谱图进行积分，积分窗口为从 t1到t2，得到样1对应的峰面积为 S1;5将样2上样于高效凝胶色谱柱进行洗脱；6 对
5、样2色谱图进行积分，积分窗口为从 t1到t2，得到样2对应的峰面积为 S2;7根据公式I:C2=S2-S1X C1I计算样2中CTAB勺浓度；8 测定待检脑膜炎球菌多糖溶液中的多糖浓度，标记为CO;9根据公式n：f=C古co x 100%n计算样2中CTAB勺百分含量。本创造根据CTAE分子与脑膜炎多糖分子间大小存在差异，利用二者在凝胶层析时的保存时间不同， 采用高效液相色谱法将 CTAE与脑膜炎球菌多糖别离，利用浓度的 CTAB乍为标准对照，从而准确测 定脑膜炎球菌多糖原液中 CTAB含量。本创造的有益效果为：本创造提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定
6、方法，当 CTAE浓度在gg/ml时，线性相关系数r大于，变异系数 CV小于3%平均回 收率在98%以上，从而建立了评价脑膜炎球菌多糖原液质量的新方法。具体实施方式以下实施例用于说明本创造，但不用来限制本创造的范围。在不背离本创造精神和实质的情况下， 对本创造方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本创造的范围。假设未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1检测方法的考察线性关系考察精密称取CTAB10mg用%NaC溶解并定容至10ml，作为对照品贮备液浓度为1mg/ml。精密吸取CTAB对照品贮备液10ml，定容至100ml容量瓶，作为对照品工作液浓度为 1
7、00gg/ml。将对照品 工作液依次稀释至浓度 100gg/ml、50gg/ml、25gg/ml、gg/ml、gg/ml，吸取不同浓度的对照品溶液， 依次进样20gl，记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标，对照品溶液 X g g/ml为横坐标进行线性回归，得其回归方程。结果见表1。表1线性关系试验结果线性方程 R值 Y=32446X+33572R=29931X?+105550R=31349X94998R3=结果说明，峰面积与浓度之间线性关系良好。检测限与定量限以信噪比为3倍时(样品主峰高约为基线噪音的3倍)的溶液浓度作为样品的检岀限，以信噪比为10倍时的溶液浓度作为样品的定量限，计算结果得CTAB勺
8、检测限为gg/ml，定量限为 gg/ml。精密度试验取浓度为gg/ml的CTAB对照品溶液，连续进样5次，记录其峰面积，并计算其变异系数 CV(%， 结果见表2。表2含量重复性测定试验结果结果说明，此方法的精密性良好。准确度试验以Y群原液做稀释液，配制 CTAB浓度100gg/ml，进样20gl，平行操作2次，记录色谱图。以 100gg/mlCTAB作为对照品，计算回收率。结果见表3。表3 Y群原液回收率结论：当CTAB浓度在gg/ml时，该方法线性相关系数r大于，变异系数CV小于3%平均回收率 在98%以上。本检测方法适用于脑膜炎多糖原液中CTAB含量的检测，具有良好的线性、精密度及准确度。
9、实施例2A群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定精密制取100gg/ml ( C1) CTAB标准溶液作为样1;取待检的A群脑膜炎球菌多糖溶液，加标CTAB浓度为100gg/ml，作为样2;将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱TSKgel G5000色谱柱，上样体积为 20gl，%NaC溶液洗脱，洗脱流速为 min，于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为，峰结束对应时间为。对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间到峰结束对应时间，得到样1对应的峰面积为3289049;将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20 g l，洗脱流速为 min，于波长214nm记录色谱图；对
10、样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间到峰结束对应时间，得到样2对应的峰面积为3230746根据公式(1)计算A群脑膜炎球菌多糖 CTAB的浓度C2= (S2-S1)X C1= (3230746-3289049)x 100=gg/ml ;测定待检 A群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为ml ( C0);根据公式(2)计算A群脑膜炎球菌多糖 CTAB的百分含量F= (C古C0 X 100%=( 9800)X 100%=%通过该实验测得样品回收率为 %实施例3C群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定精密制取100gg/ml ( C1) CTAB标准溶液作为样1;取待检的C群脑膜炎球菌多糖溶液，作为样
11、2;将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20 g l , %NaC溶液洗脱，洗脱流速为 min ,于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为，峰结束对应时间为。对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间到峰结束对应时间，得到样1对应的峰面积为3240747;将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20gl，洗脱流速为 min，于波长214nm记录色谱图；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间到峰结束对应时间，得到样2对应的峰面积为6976;根据公式(1)计算C群脑膜炎球菌多糖 CTAB勺浓度C2=(S2*S1)X C1= (6976-32407
12、47)X 100=gg/ml;测定待检C群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为ml (C0);根据公式(2)计算C群脑膜炎球菌多糖 CTAB的百分含量F= (C2C0) X100%=( 10300) X100%=% 通过该实验测得样品回收率为 %实施例4Y群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定精密制取100gg/ml ( C1) CTAB标准溶液作为样1;取待检的Y群脑膜炎球菌多糖溶液，作为样 2;将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20 g l， %NaC溶液洗脱，洗脱流速为 min，于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为，峰结束对应时间为。对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对
13、应时间到峰结束对应时间，得到样1对应的峰面积为3301241 ;将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20gl，洗脱流速为 min，于波长214nm记录色谱图；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间到峰结束对应时间，得到样2对应的峰面积为5158;根据公式(1)计算Y群脑膜炎球菌多糖 CTAB的浓度C2= (S2-S1)X 8= (5158-3301241)X 100=gg/ml;测定待检Y群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为ml (C0);根据公式(2)计算Y群脑膜炎球菌多糖 CTAB的百分含量F= (C2C0)X 100%=( 10500)X 100%=%通过该实验测得样品回
14、收率为 %实施例5W135群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定精密制取100gg/ml ( C1) CTAB标准溶液作为样1;取待检的 W135群脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2;将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为100gl , %NaCI溶液洗脱，洗脱流速为 min,于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为，峰结束对应时间为。对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间到峰结束对应时间，得到样1对应的峰面积为3321734;将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为100 g I，洗脱流速为 min，于波长214nm记录色谱图；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为
15、从峰开始对应时间到峰结束对应时间，得到样2对应的峰面积为7825;根据公式(1)计算 W135群脑膜炎球菌多糖 CTAB的浓度C2NS2-S1) XC1=(39125-) X100=gg/ml ;测定待检W135群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为ml ( C0);根据公式(2)计算 W135群脑膜炎球菌多糖 CTAB的百分含量F=(C2C0) X100%=( 9600)X100%=%通过该实验测得样品回收率为%虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本创造作了详尽的描述，但在本创造根底上，可 以对之作一些修改或改良，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本创造精神的根底上 所做的这些修改或改良，均属于本创造要求保护的范围。