《第二章组织培养技术剖析.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二章组织培养技术剖析.ppt（62页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第二章组织培养技术剖析,第一节 植物组织培养的理论基础第二节 组织培养实验室基本配置第三节 组织培养基本操作第四节 愈伤组织的诱导与继代第五节 药用植物的离体快繁和脱毒苗生产第六节 花药和花粉培养第七节 药用植物的组织培养实例,第二章 药用植物组织培养技术,第二章组织培养技术剖析,在无菌和人为控制外因条件下，将离体器官、组织、细胞、胚胎或原生质体培养在人工配制的培养基上，使其脱分化产生愈伤组织，进而分化出器官并长成完整植株的方法。,植物组织培养：,第二章组织培养技术剖析,第一节 植物组织培养的理论基础,细胞全能性脱分化与愈伤组织的概念离体条件下植株再生途径植物组织培养的类型,第二章组织培养技术
2、剖析,脱分化 外植体愈伤组织或 体细胞胚完整植株 脱分化细胞 不定器官直接生长茎尖培养（较大时）完整植株 发育幼胚培养（较大时）完整植株,第二章组织培养技术剖析,一 实验室设置二 仪器设备,第二节 组织培养实验室基本配置,第二章组织培养技术剖析,一 实验室设置,实验室是细胞工程研究的主要场所，应能以下方面的工作。,第二章组织培养技术剖析,洗涤间培养基配制间 准备室消毒间,第二章组织培养技术剖析,无菌操作室 无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。 通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。 无菌操作室
3、的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋，室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。,第二章组织培养技术剖析,培养室 室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。 培养室应配有培养架、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。,水槽,天平,冰箱,仪器药品柜,工作台,培养瓶架,烘箱,准备室,无菌室,培养室,缓冲间,超净,工作台,培养架,培养架,推拉门,灭菌待用培养瓶架,第二章组织培养技术剖析
4、,辅助实验室,鉴定室 细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。应配置各种显微镜、照相系统等。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等。,温室为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。,第二章组织培养技术剖析,实验室基本仪器设备,第二章组织培养技术剖析,高压灭菌锅,第二章组织培养技术剖析,第二章组织培养技术剖析,第二章组织培养技术剖析,第三节 组织培养基本操作,一、灭菌技术二、无菌操作技术 三、培养基的配置四、外植体的选择及处理 五. 组织培养常见问题及对策,第二章
5、组织培养技术剖析,一、灭菌技术,灭菌：是组织培养中重要的工作环节之一，指采用理化手段杀死物体表面及其孔隙内的一切微生物。,二、无菌操作技术,三.培养基的成分及其配制（一）培养基的种类,培养基是植物组织培养中的主要部分。 除了培养材料本身因素外，培养基的种类和成分等直接影响培养材料的生长和发育，应根据培养材料的种类和培养部位选择适宜的培养基。,第二章组织培养技术剖析,根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。 初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养物的培养基。,根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。,第二章组织培养技术剖
6、析,4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。 基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。 完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。 MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%,第二章组织培养技术剖析,第二章组织培养技术剖析,培养基的选择：1.无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。例如：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养。豆科多用B5培养基。2、植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总
7、体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。3、有机成分要根据培养类型考虑。如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。,第二章组织培养技术剖析,如何控制植物细胞分化,分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件 比例高时产生芽,比例低时产生根,第二章组织培养技术剖析,四、外植体的选择与处理技术一是生长在自然环境下的植物；二是在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经过离体培养的植物。,第二章组织培养技术剖析,取材原则（1）从健壮的植株上取材，不要取有伤口和病虫的材料（2）晴天的
8、中午或下午取材，不要在雨天、阴天或露水未干时取材。（3）最好使用无菌苗。,第二章组织培养技术剖析,外植体的选择 大小要适宜,不宜太小。外植体的组织块要达到2万个细胞（5-10mg）以上才容易成活；同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别；植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织；不同物种相同部位的外植体其分化能力可能大不一样。,第二章组织培养技术剖析,第四节 愈伤组织的诱导与继代,第二章组织培养技术剖析,一、愈伤组织的诱导 1. 外植体的选择 一般以幼嫩的组织或器官为宜。如根、茎、叶、果实、子房、花粉、花瓣等各种器官或组织。,第二
9、章组织培养技术剖析,种子是诱导愈伤组织的很好的起始材料，因为：可将整粒种子放在加有生长物质的培养基上使其直接产生愈伤组织；在无激素的培养基上发芽，可产生无菌的根、茎、叶用作外植体；或直接剪下根原基及芽尖用作外植体。,第二章组织培养技术剖析,2. 外植体材料的准备与消毒 外植体的消毒一般采用次氯酸钠(市面上售的一般为10-14%有效氯),使用时按1:10稀释,消毒时间以材料定,消毒后无菌水冲洗4-5次; 或用0.1%升汞消毒。,第二章组织培养技术剖析,3. 愈伤组织诱导 愈伤组织的诱导采用的培养基的基本成分相似，但对于不同植物，不同物种都要对培养成分作相应改动，尤其是激素的成分和浓度是极为重要的
10、因素。,第二章组织培养技术剖析,二、愈伤组织的继代培养 愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一次培养基称一代继代培养(subculture) 。,为什么要进行继代培养？,第二章组织培养技术剖析,为什么要进行继代培养？经过诱导培养一段时间后，培养基里的养分耗尽培养基已干燥生长物已充满培养瓶培养物需要扩繁琼脂培养基褐化或发黑 需要让培养物在一种新的营养条件下生长培养基由于植物材料的原因使pH降低，导致培养基液化,一般培养的愈伤组织需要每46周继代一次。 第一次转移的愈伤不宜过小，否则生长会受抑制。一旦愈伤建立起来，多数愈伤系需要每月继代一次。继代时一般情况下
11、不需改变原培养基的成分，但很多物种需要将生长素降低些，尤其是使用2，4-D时。,第二章组织培养技术剖析,三 、愈伤组织分化与植株再生,途径：器官发生：体细胞胚胎发生：,表现单极分化：愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或者有芽无根的现象。双极分化：愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽，有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培养瓶内靠愈伤组织提供养料，这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。,第二章组织培养技术剖析,先芽后根：愈伤组织中产生多个分生中心，从中仅分化芽，待芽长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部即可分化
12、出根; 有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根端也能分化出芽。,第二章组织培养技术剖析,四、试管苗移栽,试管苗不同于田间植株：试管苗的角质层（蜡质层）发育很差，移栽易失水根很弱，功能差自然条件下，植物与真菌、细菌存在一种共生关系，试管苗缺乏这种关系。所以试管苗移栽入土时需要一个适应过程,第二章组织培养技术剖析,试管苗移栽时应注意如下问题：,防止被病菌感染：琼脂要
13、冲洗干净，最好用无菌土为防止根受伤，过筛的细土为了保证移栽时顺利成活，幼苗应在低盐培养基上生根，1/2MS或knop营养液有时移栽后在低温处理一段时间以打破休眠应该采取保持湿度的措施,第二章组织培养技术剖析,五. 组织培养常见问题及对策1、污染及控制 污染：指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。,第二章组织培养技术剖析,污染原因（从病原菌分析）（1）细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后12天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。（2）真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后310天才能发现。主要是霉菌污染。,第二
14、章组织培养技术剖析,污染途径：（1）外植体带菌（2）培养基及接种器具灭菌不彻底（3）接种操作时带入（4）环境不清洁,第二章组织培养技术剖析,污染的预防措施： A、防止外植体带菌B、保证培养基及接种器具彻底灭菌C、操作人员严格遵守无菌操作规程D、 保证接种与培养环境清洁,2、外植体褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。 原因：植物组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化。褐变过程中产生醌类物质，呈棕褐色，扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。,第二章组织培养技术剖析,减轻褐变现象发生的方法 选择合适的外植体 一般来说，最
15、好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 合适的培养条件 调整无机盐成分、植物生长物质水平、适当降低培养基温度，及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。,第二章组织培养技术剖析,使用抗氧化剂 半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。 连续转移 对容易褐变的材料可间隔1224h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,第二章组织培养技术剖析,3、继代培养时材料的玻璃化 当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。,红豆杉愈伤组织和再生苗,南方红豆杉,曼地亚红豆杉,石斛组培分苗,石斛组织培养,净化组培苗车间,第二章组织培养技术剖析,石斛组培分苗,石斛组织培养,净化组培苗车间,第二章组织培养技术剖析,石斛组培分苗,石斛组织培养,净化组培苗车间,