绣球菌子实体多糖地分离与纯化.doc

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1、绣球菌子实体多糖分离与纯化一、材料菌株:绣球菌子实体二、方法与步骤1、预处理粉碎:取200体绣球菌子实体洗净、阴凉处晾干,机械粉碎。2、提取粗多糖取200g绣球菌子实体粉末与 2000ml水中浸泡24h。将浸泡后的液体置电磁炉上煮往锅内增添水,使加水量大约为6000ml。煮一定时间后,将液体滤出。于旋转蒸发仪中浓缩至适当体积 ,加入2倍体积的95%的乙醇,醇沉24h,用离心 机3000 r/min 的转速离心10min,弃去上清液,所得沉淀放入培养皿中于 5060 C电热真空 干燥箱中烘干,得粗多糖并分别称取粗多糖质量。3、葡聚糖含量测定试剂:(1 )浓硫酸:分析纯,95.5%(2 ) 80%

2、苯酚:80g苯酚(分析纯重蒸馏试剂)溶于 20ml水,冰箱中避光长期储存。(3) 6%苯酚:以80%苯酚配制。(现配现用)(4 )分析纯葡萄糖。操作(1 )制作标准曲线:准确称取葡萄20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至 2.0ml,然后加入 6%苯酚1.0ml 及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却,沸水中加热20分钟,取出冷却至室温。于490nm 测光密度值。以2.0ml水按同样显色操作为空白,质量浓度为横坐标,A为纵坐标,得标准曲线。回归方程:A=0.0113C+0.015( r=0.9987 )线性范围

3、在 10-70 微克(2)样品含量测定:精密称取粗多糖10mg,置100ml量瓶中,蒸馏水定容,质量浓度为 0.1mg/ml 。吸取样 品溶液1ml ( 5份),分别置于20ml试管中,加入蒸馏水使其最终体积为 2ml,各管加入 6%苯酚1ml,混匀,迅速加入浓硫酸 5ml,摇匀,静置5min后,放入沸水中加热 20min , 取出后冷却置室温,在 490nm处测定吸光度。以标准曲线计算多糖含量。4、脱蛋白(Sevag法)样品溶液:Sevag试剂=5:1Sevag试剂的配制三氯甲烷:正丁醇=5:1充分振荡1 2h,静止,离心,取上清重复,至无游离蛋白为止。5、透析剪取适当长度的截留分子量800

4、0的透析袋,用透析袋夹子夹住一端,灌入除蛋白后多糖溶液,再用透析袋夹子夹住另一端,放入一只大烧杯中,用一导管将水通入烧杯底部,逆向对流水透析 48h,以除去小分子的无机盐、低聚糖等杂质,即得到粗多糖。6、多糖的分级纯化6.1 DEAE 52色谱柱层析树脂预处理称取DEAE 一 52纤维素树脂50g,在25 C蒸馏水中浸泡24h,使其充分溶胀。再用双蒸 水反复洗涤,去除纤维素单体或碎片的悬浮颗粒。抽干,用0.5mol/L NaoH 溶液500mL浸泡30min,适当搅拌后,用双蒸水洗至中性;再用0.5mol/L 盐酸溶液 500mL浸泡30min,适当搅拌后,用双蒸水洗至中性;最后用0.5mol

5、/L NaOH 溶液500mL浸泡30min,使之转为OH-型,适当搅拌后,用双蒸水洗至中性。抽干,备用。装柱与平衡将预处理好的DEAE 52纤维素树脂加适量双蒸水,搅拌,用超声脱气后,沿玻璃棒 小心缓慢一次灌到 2.0*60cm 层析柱,同时轻轻敲击柱壁,使填料沉降均匀、致密,柱高 45cm,然后静态沉降24h,使层析柱达到平衡状态。上样洗脱将脱蛋白后的粗多糖全部溶于水,经DEAE(OH)型纤维素柱(2 6cm XIOOcm)层析,先用蒸馏水洗脱,自动收集器收集,每管15min,用苯酚-硫酸法逐管检测多糖含量,一直洗至多糖为 阴性反应然后用01mol L-1的NaCI作梯度洗脱,每管6min

6、,用苯酚-硫酸法逐管检测多糖 含量,一直洗至多糖为阴性反应,合并主峰部分,乙醇沉淀多糖,冷冻干燥。6.2 SephadexG 100 凝胶柱层析自然沉降法装 SephadexG 100凝胶色谱柱(2 X60cm),脱气后用 ddH 2O(1000ml) 平衡层析柱,流速为 3d/min .取6.1所得的葡聚糖100mg溶于5mLddH 2O中,上样于 Sephadex G 100凝胶色谱柱(2 X60cm),以ddH 2O为流动相,流速为每分钟 3滴,用 自动部分收集器以每管 5ml收集洗脱液,将收集到的样品溶液用苯酚硫酸法在490nm波长下比色检测多糖,以试管数为横坐标,以吸光度值为纵坐标,做SephadexG 100凝胶色谱柱层析洗脱曲线图然后合并各个主峰溶液,低压冷冻干燥,得到纯多糖级分。

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