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1、实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,层析技术实验原理实验思路实验流程及操作注意事项,层 析 技 术,1层析法：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术.,2. 依据：混合物中各组分的理化性质差异吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。,固定相固定不动流动相对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。,3基本原理：固定相和流动相,4分类：流动相的物理状态：气
2、相和液相 气液/固，液固/液方式：纸、薄层、柱原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相,5凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。,基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液,交联葡聚糖凝胶,多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为Sephadex G系列G交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-10
3、0，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。,长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接,凝胶层析的基本原理,样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出大小分子彼此分开,l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分
4、子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中,数学模型,Vo Vi Vt,Vi凝胶孔内水（内水）Vo颗粒间水（外水）Vg凝胶体积总体积Vt= Vi +Vo+Vg,Kd分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数Ve洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Ve=Vo+KdVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图,（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+KdVi，01,影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小分离样品量凝胶型号分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定
5、范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%5%*凝胶的再生,交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数,实验原理,透析及超滤法盐析、有机溶剂/免疫沉淀电泳凝胶层析离子交换层析超离心,共性：*生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析*蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷盐析/有机溶剂沉淀*两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反之带正电电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性 免疫沉淀 个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同,分离依据：蛋白质理化性质的和个性,实验思路
6、,分段盐析去除杂蛋白,凝胶层析脱盐,交联葡聚糖吸水浓缩,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,上午完成,下午完成,先粗后细,分段盐析：常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液pH约4.55.5，可用硫酸/氨水按需要调节pH值。分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所需的盐浓度、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及pH可使各种蛋白质分段沉淀。,实验流程及操作注意事项,影响因素：温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白
7、质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。,凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。固定相：sephadex G-25流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl）原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。,浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。,注意事项：1硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入2流洗柱子：34个柱长3上样：转圈滴加，起跑
8、线一致4防止柱上液层干涸5洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂6G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高0.5ml7. 用过的G-25干胶倒入收集缸，回收利用。,鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳,电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场,COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PHPI,电泳用于分离物质的原理：,蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电
9、场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。,醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液,清蛋白 1 2 ,清蛋白（albumin，A）：3848g/L球蛋白（globulin，G）：1530g/LA/G：正常值1.52.5,【操作步骤】1点样：取经巴比妥缓冲液浸透的28cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置510分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。2通电：接通电源，调节电压为4050V，通电2 2.5h，关闭电源，停止电泳。3染色：薄膜浸入氨基黑B染色液25分钟。4漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗45次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。,5）醋酸纤维素薄膜电泳在临床上的应用,实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,