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1、目的要求：熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素 a和 b 的方法及其计算实验原理：如 果 混 合 液 中 的 两 个 组 分 ，它 们 的 光 谱 吸 收 峰 虽 然 有 明 显 的 差 异 ，但 吸 收 曲 线 彼此有些重 叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据 Lambert-Beer 定律，通 过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到 两种组分的含量。如 图 z-4 叶 绿 素 a 和 b 的 吸 收 光 谱 曲 线 ，叶 绿 素 a 的 最 大 吸 收 峰 在 663nm ，叶 绿 素 b在 645nm ，吸收曲线彼此又有重叠。图 z-4 叶
2、绿 素 a 和 b 的 吸 收 光 谱 曲 线横坐 标为波长 （nm） ，纵坐标 为比吸收 系数根 据 Lambert-Beer 定 律 ， 最 大 吸 收 光 谱 峰 不 同 的 两 个 组 分 的 混 合 液 ， 它 们 的 浓 度 C 与 光 密 度 OD 之 间 有 如 下 的 关 系 ：OD1=Ca · ka1+Cb · kb1 （ 1 ）OD2=Ca · ka2+Cb ·kb2 （ 2） 式 中 ： Ca 为 组 分 a 的 浓 度 ， g/L 。Cb 为 组 分 b 的 浓 度 ， g/L 。OD1 为 在 波 长 1（ 即 组 分 a 的
3、 最 大 吸 收 峰 波 长 ）时 ，混 合 液 的 光 密 度 OD 值 。 OD2 为 在 波 长 2（ 即 组 分 b 的 最 大 吸 收 峰 波 长 ）时 ，混 合 液 的 光 密 度 OD 值 。 ka1 为 组 分 a 的 比 吸 收 系 数 ，即 组 分 a 当 浓 度 为 1g/L 时 ，于 波 长 1 时 的 光 密 度 OD 值 。kb2 为组分 b的比吸收系数，即组分 b当浓度为 1g/L 时，于波长2时的光密 度 OD 值 。ka2 为 组 分 a （ 浓 度 为 1g/L ） ， 于 波 长 2 时 的 光 密 度 OD 值kb1 为组分 b（浓度为 1g/L ），于
4、波长1 时的光密度 OD 值从文献中可以查到叶绿素a和 b的80%丙酮溶液，当浓度为 1g/L 时，比 吸收系数k值如下：波 长（ nm）叶 绿 素 a叶绿 素 b66382.049.2764516.7545.60将表中数值 代入上式（1）、（2），则得：OD663=82.04 × Ca+9.27 ×CbOD645=16.75 × Ca+45.60 × Cb经过整理之后，即得到下式：Ca=0.0127 OD663-0.00269 OD645Cb=0.0229 OD645-0.00468 OD663如果把 Ca，Cb 的浓度 单位从原 来的 g/L 改为
5、mg/L ，则上 式可改写为下列形式：Ca=12.7 OD663-2.69 OD645（ 3 ）Cb=22.9 OD645-4.68 OD663（ 4 ）CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21 OD645（ 5 ）（ 5 ） 式 中 CT 为 总 叶 绿 素 浓 度 ， 单 位 为 mg/L 。 利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素 a 和 b 及总叶绿素的浓度（mg/L ）。附注一般 大学 教 学实验 室 所用的分光 度 计多为 721 型 ，属低级 类型 ，其 单色 光的 半波宽要比中级类型的751型宽得多，而叶绿素 a和b吸收峰的波长相差仅18nm （ 66
6、3-645nm ），难 以 达 到 精 确 测 定 。此 外 有 时 还 由 于 仪 器 本 身 的 标 称 波 长 与 实 际 波 长不符，测定的正确性就更差，不适用于测定。751 型有时也由于波长不够准确， 会带来一定误差。可用叶绿素对波长进行校正。为校正仪器波长所需的叶绿素 a和 b 的需要量很少，用纸层析法很快就能分离 制得。取植物叶子约 1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在 3mm 厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器 中进行上行层析，溶 剂为含有 0.5%丙酮的石油醚。层析结束，用 剪刀小心地剪下蓝 绿色的叶绿素 a 和黄绿色的叶
7、绿素 b，注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。最后分 别 浸 于 80% 丙 酮 中 ， 洗 下 叶 绿 素 a 和 b三 实验器 材与试剂：1实验仪器 高级型分光光度计、离心机、台 天平、剪 刀、研钵 、漏斗、 移液管 2实 验 试剂 丙 酮、 碳酸 钙。3 实 验 材 料 植 物 叶 片 。四 操作步 骤：1、色素的提取：取新鲜 叶片，剪去 粗大的 叶脉并剪成碎块，称取 0.5g 放 入研钵中 加 纯 丙 酮 5ml ， 少 许 碳 酸 钙 和 石 英 砂 ， 研 磨 成 匀 浆 ， 将 匀 浆 转 入 量 筒 中 ， 并 用 适 量 80% 丙 酮 洗 涤 研 钵 ， 用 80% 丙 酮
8、定 容 至 10ml ， 吸 取 2.5ml 加 入 有 10ml80% 丙 酮 的 量 筒中，过滤，滤液备用。2、测 定光密度：取 上述色素提取液 4ml，转 入比色杯中，以 80%丙酮为对照，分 别 测 定 663nm 、 645nm 处 的 光 密 度 值 。3、按公式（3）、（4）、（ 5）分别计算色素提取液中叶绿 素 a、叶绿素 b、 及叶绿素 a+b 的浓度。再根据稀释倍数分别计算每 g 鲜重叶片中色素的含量。【注意事项】1.由于植物叶子中含有 水分，故 先用纯 丙酮进行提取，以 使色素提取液中 丙酮的最 终 浓 度 近 似 80% 。2.由于叶绿素 a、b 的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差， 因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。五 作业 ：1、试比较阴生植物和阳 生植物的叶 绿素 ab的比值有无不同。2、分光光度法和比色法 有何异同？叶绿素 a 和 b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰 波长进行叶绿素 a和 b的定量分析，为什么？【此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，本文档可自行编辑和修改内容，感谢您的支持！ 】