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1、补肾固齿丸对大鼠实验性牙周炎牙槽骨重建的影响丁 一1，杨 恒1，文 钦2 (610041成都，四川大学华西口腔医院牙周科1；400015重庆，重庆医科大学附属口腔医院牙周粘膜科2)摘要 目的 研究补肾固齿丸对大鼠实验性牙周炎牙槽骨重建的影响，进一步探讨补肾固齿丸对牙周炎的治疗机制。方法 成功建立大鼠牙周炎模型之后，大鼠分为正常组、牙周炎模型组、补肾固齿丸组，给予补肾固齿丸治疗，采用放射免疫法测定血清骨钙蛋白与型胶原交联C端肽浓度，同时采用显微CT对大鼠牙槽骨进行三维重建，以评价补肾固齿丸对大鼠实验性牙周炎牙槽骨修复重建的影响。结果 经过补肾固齿丸治疗1个月后，治疗组补肾固齿丸组血清骨钙蛋白与型
2、胶原交联C端肽浓度分别为（0.859 1±0.156 9）、（2.038 6±0.407 5）较之牙周炎模型组分别为（1.806 4±0.258 5）、（3.056 0±0.461 5）（1.8064±0.2585，3.0560±0.4615）分别下降为（0.8591±0.1569，2.0386±0.4075，（P<0.05）。治疗组补肾固齿丸组大鼠牙槽骨的骨小梁体积分数（0.304 1±0.010 0）明显高于牙周炎模型组（0.181 6±0.020 0），P<0.05），且骨小梁
3、数量（3.124 4±0.100 0）略高于牙周炎模型组（2.088 9±0.200 0），P>0.05），而治疗组补肾固齿丸组的骨小梁分离度（0.575 1±0.020 0）较之牙周炎模型组（0.611 0±0.030 0），P<0.05）有降低的趋势（P<0.05）。 结论 补肾固齿丸能改善牙周炎大鼠牙槽骨代谢状况，促进牙槽骨改建，对牙周炎具有一定的辅助治疗作用。关键词 补肾固齿丸；大鼠；实验性牙周炎；显微CT中图法分类号 文献标志码 AEffects of Bushenguchiwan on alveolar bone recon
4、struction of rats with experimental periodontitisDing Yi1, Yang Heng1 , Wen Qin2 (1Deptartment of Periodontology, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu, 610041;2Department of Periodontology and Oral Medicine, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University,
5、Chongqing, 400015, China)Abstract Objective To explore the influence of Bushenguchiwan on alveolar bone reconstruction of rats with experimental periodontitis，and to discuss the treatment mechanism of Bushenguchiwan. Methods The model of experimental periodontitis of rats were established by means o
6、f steel wire, high- carbohydrate diet and Periopathogens noculation. We used Bushenguchiwan to treat them. The content variation of osteocalcin (OCN) and pyridinoline cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type collagen (ICTP) in serum were observed by radioimmunoassay (RIA). Micro-CT and soft
7、ware digitized specimens were reconstructed three-dimensionally for parameter assessment of alveolar bone(bone volume /total volume , trabecular number , trabecular separation) .Results Rat experimental periodontitis models were successfully established by steel wire, high- carbohydrate diet and Per
8、iopathogens inoculation. After 30 days treatment of Bushenguchiwan with the level of OCN and ICTP in serum were decreased in treatment group(0.8591±0.1569，2.0386±0.4075,P<0.05), compared with model control group(1.8064±0.2585，3.0560±0.4615). After treatment ,BV/TV of alveolar
9、bone had distinct improvement (0.3041±0.0100,P<0.05), and Tb.N showed a trend of increae in treatment group(3.1244±0.1000,P>0.05) ,in addition, Tb.Sp in treatment group(0.5751±0.0200) was inferior to model group（0.6110±0.03000,P<0.05）. Conclusion Bushenguchiwan could imp
10、rove alveolar bone reconstruction of rats with experimental periodontitis.Key words Bushenguchiwan; rats; experimental periodontitis; micro-CTCorresponding author: Wen Qin, Tel:86-23-88860029,E-mail: strawberry .wq 通信作者 文 钦，E-mail: strawberry .wq 现代医学认为细菌感染是牙周炎的始动因子，微生物与宿主的相互作用决定了疾病的过程与进展，二者之间的力量失衡导
11、致了牙周组织的破坏；祖国医学则认为牙周炎 “肾虚为内因，湿热为外因”，“齿者骨之所终，髓之所养，肾实主之，故肾衰则齿豁，精固则齿坚”，对于牙周炎的辩证施治原则是：肾虚当以专补肾气为主，就能达到固齿的目的。为此我们采用了扶正与祛邪兼顾的“补肾固齿丸”方剂来治疗牙周病。补肾固齿丸是我国著名牙周病学专家张举之教授研发的中成药，此方以补肾祖方六味地黄丸为核心，辅以骨碎补救齿骨之损伤，紫河车大补元气，枸杞滋肾生津，牛膝强筋壮骨，佐以野菊、漏芦、茯苓、泽泻清湿热消火毒等达到扶正祛邪、固齿强身的目的1。牙槽骨持续地进行骨的转换，在此过程中产生的一些代谢物，称为骨转换生化标志物，它们是反映机体骨代谢状况的重要
12、指标，而这些标志物在检测牙周组织状况、评估牙周炎治疗效果和判断预后等方面具有重要的作用2。骨代谢标志物主要分为非胶原蛋白标志物与胶原蛋白标志物，而骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)与型胶原交联C端肽(pyridinoline cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type collagen，ICTP)则被认为是这两类标志物的代表，得到了较为广泛的研究。CT的兴起，尤其是近年发展起来的分辨率达到110m的显微CT（micro computed tomography，Micro-CT）作为一种无损检测手段3，具有了X线无法企及的优势，被看
13、作是目前研究骨立体结构、容量和微结构改变的较合适的检测方法4。牙槽骨破坏吸收是牙周炎最重要的临床表现，本研究从骨转换标志物以及Micro-CT两方面来评价补肾固齿丸对大鼠实验性牙周炎牙槽骨修复重建的影响。1 材料与方法1.1实验动物 健康普通级SD大鼠40只，实验动物质量合格证SCXK(川)2009-09，购于四川大学华西医学中心实验动物中心，雌雄各半，体质量200g左右。1.2 实验试剂补肾固齿丸药粉由成都九芝堂金鼎药业有限公司提供（批号：S-090401），碘125I骨钙蛋白放射免疫试剂盒（北京普尔伟业生物科技公司，批号090803），碘125IICTP放射免疫试剂盒（Orion，芬兰，批
14、号：68601）。1.3 器械与设备持针器、钢丝剪、骨钳、眼科剪、平镊、灌胃器（四川大学华西口腔医学院动物中心提供），细菌厌氧培养箱（浙江义务冷冻机总厂，义乌），光学显微镜Nikon Eclipse 80i（Nikon，日本），Micro-CT（Sky-scan,比利时）。1.4 实验方法1.4.1建模方法 40只健康SD大鼠，以3%苦味酸溶液标号后按照性别、体质量分层，采用随机数字表法，随机选择16只大鼠作为正常组，给予常规饮食，正常饲养。余下的24只均进行牙周炎造模。全麻下，牙周炎模型组左侧第一磨牙结扎正畸丝，结扎完成后，按照每只老鼠每天20mg/d的剂量，将规格125mg/粒阿莫西林Am
15、oxicillin（山东鲁抗医学股份有限公司，济宁）混入饮水中喂饲，以抑制不利于牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas Gingivalis，P.g）生长的内源性细菌，共3d。在左侧上颌第一磨牙的龈沟内接种1ml 1.5×1012 CFU/L的P.g菌悬液，每48 h小时接种1次，共接种3次。牙周炎模型组大鼠以10%高糖饮水喂饲，正常组大鼠饲喂饮用水。从大鼠上颌第一磨牙结扎钢丝完成后起计算，建模时间共计21 d。1.4.2组织学观察 建模结束后，正常组、牙周炎模型组分别选取8只大鼠，处死后，迅速分离上颌骨，10%中性福尔马林固定24 h，通过病理切片观察大鼠上颌第一磨牙牙周组织的
16、变化，以确定建模是否成功。1.4.3 补肾固齿丸治疗大鼠实验性牙周炎1.4.3.1 实验分组 大鼠牙周炎模型建立成功后去除结扎丝，正常饲养1周，采用随机区组设计，将成功建立牙周炎模型的16只大鼠按照随机数字表法分为2组：牙周炎模型组、补肾固齿丸组，建模成功后余留的正常大鼠作为正常对照组，各组大鼠均为8只。根据药理实验方法学5等效剂量系数折算法，剂量大鼠=6.3×剂量人（mg/kg），换算大鼠的给药剂量为0.8g/（kg·d），采用经口灌胃给药方式进行给药。正常组、牙周炎模型组，均以生理盐水灌胃，剂量为10ml/（kg·d）。1.4.3.2 血清骨转换标志物的测定
17、血清的收集与保存：给药30d后，各组大鼠12h禁食、禁饮，股动脉放血收集血浆，离心3000r/min，10min，EP管分装血清，保存血清于-80冰箱内备用。骨转换标志物的测定：将正常组、牙周炎模型组、补肾固齿丸组的血清送于四川大学基础医学院与法学院同位素室采用放射免疫方法6（radioimmunoassay，RIA)测定各组血清OCN以及ICTP浓度的变化。1.4.4 microcomputed tomography(Micro-CT)三维影像学观察1.4.4.1设备及方法 Micro-CT 80（Scanco Medical ,瑞士）：像素2048×2048，层距10m，整合时间
18、300ms，每180°投射1 000次，HP Integrity 64位工作站，64位采集/重建/分析软件。各组大鼠处死后，分离出上颌左侧牙槽骨，置于10%中性福尔马林中保存备用。图像采集时将标本取出，置于Micro-CT获取图像，每个样本扫描时间8090min。图像采集完成后，选取第一磨牙根分叉区域牙槽骨作为感兴趣区（region of interest,，ROI），软件分析，三维重建，获取数据。1.4.4.2 检测指标 骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)，：指骨性结构的体积与样本总体积的比值，即矿化组织的比值（），该数值越大，表明骨小梁含量
19、越多。骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）：用于描述骨量变化（mm-1），在骨小梁厚度一定的前提下，数量越多，骨量越多。骨小梁分离度（trabecular separateion，Tb.Sp）：指骨小梁之间的平均距离（mm），用于描述骨小梁结构形态，骨小梁之间的距离越大，分离度越大。1.5 统计学分析使用SPSS13.0统计软件进行分析，对血清骨转换标志物以及Micro-CT结果采用随机区组设计的单因素方差分析进行组间比较。2 结果2.1 大鼠牙周炎模型的建立病理组织学观察结果显示，正常大鼠的结合上皮附着于釉牙骨质界处，牙周膜纤维走向正常，牙槽骨未见吸收（图1A）。建模大
20、鼠结合上皮向根方增殖、延伸，附着丧失程度较重，炎细胞浸润，牙槽嵴顶高度降低，牙槽骨明显吸收，证实成功建立了大鼠实验性牙周炎模型（图1B）。ABCEJABCEJABPDAB A：正常组；B：牙周炎模型组 CEJ：釉牙骨质界；AB：牙槽骨图1建模结束后正常组与牙周炎模型组病理切片病理学观察（HE×100）2.2 给药后各组血清骨转换指标的测定 给予补肾固齿丸治疗，发现补肾固齿丸组的血清OCN与ICTP浓度牙周炎模型组的显著低于牙周炎模型组(P<0.05)，说明给予补肾固齿丸能够降低大鼠牙槽骨的骨转换率，减缓牙周炎进程中的牙槽骨吸收。见表1。 表1 给药后各组血清中OCN和ICTP的
21、浓度（ng/ml，x±s）组别 OCN ICTP 正常组 0.504 2±0.109 9a 1.464 2±0.403 3a牙周炎模型组 1.806 4±0.258 5 3.056 0±0.4615补肾固齿丸组 0.859 1±0.156 9a 2.038 6±0.407 5aa：P<0.05，与同期牙周炎模型组比较2.3 给药后Micro-CT检测结果 给药1个月后，大鼠牙槽骨Micro-CT三维重建分析结果显示（图2），补肾固齿丸组的骨小梁体积分数BV/TV明显高于牙周炎模型组，牙槽骨骨小梁分离度Tb.Sp低于牙周
22、炎模型组（P<0.05），补肾固齿丸组的牙槽骨骨小梁数量Tb.N略多于牙周炎模型组，但差异没有统计学意义（P>0.05）。见表2。 表2 给药后各组Micro-CT检测结果（x±s）组别 BV/TV(%) Tb.N(mm-1) Tb.Sp(mm) 正常组 0.4641±0.0150a 5.8659±0.1000a 0.1307±0.0109a牙周炎模型组0.1816±0.0200 2.0889± 0.2000 0.6110±0.0300补肾固齿组 0.3041±0.0100a 3.1244 ±
23、0.1000 0.5751±0.0200aa：P<0.05，与同期牙周炎模型组比较ABCCA：正常组；B：牙周炎模型组；C：补肾固齿丸组图2 给药1个月后各组Micro-CT三维重建图3 讨论OCN是由成骨细胞、成牙本质细胞和软骨细胞合成分泌的一种小分子非胶原蛋白，在调节骨钙的代谢方面发挥着十分重要的作用。当骨吸收和骨形成相偶联时，OCN为骨转换的标志；当骨吸收与骨形成解偶联时，OCN为骨形成的一项特异性指标，在牙周炎的发生、发展过程中，牙槽骨不断的地进行骨转换，包括了骨吸收与骨形成连续复杂的过程，在此过程中骨吸收与骨形成相互偶联，OCN则是反映骨转换的标志物，当牙槽骨吸收活跃
24、时，牙槽骨骨转换率升高，血清中的OCN浓度可能升高7。McCracken等8观察糖尿病大鼠牙槽骨代谢改变，结果发现糖尿病大鼠在牙槽骨吸收活跃时，血清OCN水平升高，并由此推测OCN浓度升高主要是由于骨转换率升高，骨吸收活跃所致。孙靖临等9检测牙周炎患者与牙周健康者血清OCN浓度，发现前者的血清OCN的浓度显著高于后者，提出牙周炎患者血清OCN含量较高可能是由于骨转换速率升高，骨吸收率大于骨形成率所致。骨胶原是骨基质中主要的有机成分，其中型胶原占骨胶原的97%以上，并且是矿化骨组织中唯一的胶原。ICTP由型胶原降解后形成，是部分紧密交联的肽段结构域，具有特异性强，在肾脏中不被降解，、稳定性高等特
25、点。近来研究结果显示它与骨吸收的组织形态学以及钙动力学研究的骨吸收率有很好的相关性，是目前广泛采用的骨吸收标志物10。Gursoy等11发现在重度牙周炎患者唾液中ICTP的浓度显著高于健康对照组，他们认为ICTP可作为牙周炎牙槽骨吸收的标志物。中医理论认为牙周炎主要是肾气虚亏、胃火炽热和气血不足所致。肾主骨，齿为骨之余，牙齿与骨由肾气充养。肾精不足，牙齿易于松动、脱落。牙槽骨的修复重建是牙周病治疗的首要目的，补肾固齿丸如何壮骨固齿，既往研究较为少见，采用的方法也主要通过测定血清骨钙蛋白、碱性磷酸酶、钙、磷水平变化12来评价补肾固齿丸对牙槽骨的影响，研究方法较为单一，选定的骨转换标志物敏感性与特
26、异性不高。本实验选用骨吸收敏感标志物型胶原交联C端肽ICTP，结合骨钙蛋白OCN评价补肾固齿丸对大鼠实验性牙周炎骨代谢的影响。本实验通过建立大鼠实验性牙周炎模型后给予补肾固齿丸治疗，发现补肾固齿丸组的血清OCN与ICTP浓度牙周炎模型组的显著低于牙周炎模型组，说明给予补肾固齿丸能够降低大鼠牙槽骨的骨转换率，减缓牙周炎进程中的牙槽骨吸收。以往主要是通过组织病理学、X光影像学评价牙槽骨改建。组织病理学过观察牙周组织中炎症细胞的浸润，、牙槽嵴的高度和形态等，判断牙周炎的形成和破坏程度，但组织切片制作过程较为繁复，且无法进行定量分析。而X光影像学能够观察牙槽骨吸收水平以及牙槽骨骨密度变化，但X光片的二
27、维性决定了它评价牙槽骨改建的局限性。Micro-CT从三维立体结构上分析骨小梁的形态结构，可作为组织分析的一种经济有效方法，样本无需特殊处理，不会影响随后的组织学分析，并且可互为补充，它能够更加准确地、定量地评价牙槽骨改建13。杨霞等14通过运用Micro-CT评价益气滋肾合剂对牙周炎大鼠牙槽骨微观形态的影响，发现益气滋肾合剂能够增加牙槽骨密度，对大鼠牙周炎具有治疗作用。本实验通过建立大鼠实验性牙周炎，经过补肾固齿丸治疗1个月后，运用Micro-CT对大鼠牙槽骨进行三维学分析，定量的评价补肾固齿丸对牙槽骨改建的作用。Micro-CT检测结果显示：用药1个月后，给予补肾固齿丸治疗1个月后后，补肾
28、固齿丸组的骨小梁体积分数BV/TV明显高于牙周炎模型组，牙槽骨Tb.Sp骨小梁分离度低于牙周炎模型组（P<0.05）。从Micro-CT分析得到的各项指标说明治疗组补肾固齿丸组的大鼠牙槽骨状况优于牙周炎模型组，该药具有促进牙槽骨骨重建的有效性。本研究以SD大鼠为实验对象，采用“牙颈部钢丝结扎+高糖饮食+接种牙龈卟啉单胞菌”的方法，21d后通过组织病理切片观察，确定成功建立了典型的SD大鼠实验性牙周炎模型。建模成功后给予补肾固齿丸0.8g/（kg·/d）治疗1个月后，通过放射免疫法检测大鼠血清中骨代谢标志物的变化，并采用Micro-CT三维学定量分析治疗组补肾固齿丸组和模型对照正
29、常组、牙周炎模型组标本的骨小梁各项指标。各项指标的统计学结果显示，补肾固齿丸通过能显著改善牙周炎大鼠牙槽骨代谢状况，促进牙槽骨改建，延缓牙周组织破坏，对牙周炎具有一定的辅助治疗作用。参考文献：1 丁一，安志国，文钦, 等.论补肾固齿丸治疗牙周病J.中外医学研究, 2010, 8(2):69-70.2 文钦，冯琛琛，丁一. 骨转换生化标志物在牙周领域中的应用J.国际口腔医学杂志, 2010, 37(1):51-55.3 Borah B, Gross G J, Dufresne T E, et al. Three-dimensional microimaging (MRmicroI and mic
30、roCT), finite element modeling, and rapid prototyping provide unique insights into bone architecture in osteoporosisJ. Anat Rec, 2001, 265(2): 101-110.4Buchman S R, Sherick D G, Goulet R W, et al. Use of microcomputed tomography scanning as a new technique for the evaluation of membranous boneJ. J C
31、raniofac Surg, 1998, 9(1):48 - 54.5 徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学M.第3版.北京：人民卫生出版社，2000:203-204.6 Ozcaka O, Nalbantsoy A, Bicakci N, et al. Plasma levels of C-telopeptide pyridinoline cross-links of type I collagen and osteocalcin in chronic periodontitisJ. Inflammation, 2011, 34(3):203-208.7 Giannobile W V, A
32、l-Shammari K F, Sarment D P. Matrix molecules and growth factors as indicators of periodontal disease activityJ. Periodontol 2000, 2003, 31: 125-134.8 McCracken M, Lemons J E, Rahemtulla F, et al. Bone response to titanium alloy implants placed in diabetic ratsJ. Int J Oral Maxillofac Implants, 2000
33、, 15 (3): 345-354.9 孙靖临,孟焕新. 血清骨钙素与牙周炎的关系J. 现代口腔医学杂志, 2002,16(2) :143-144.10 Seibel M J. Biochemical markers of bone metabolism in the assessment of osteoporosis: useful or not?J. J Endocrinol Invest, 2003, 26(5): 464-471.11 Gursoy U K, Kononen E, Pradhan-Palikhe P, et al. Salivary MMP-8, TIMP-1, an
34、d ICTP as markers of advanced periodontitisJ. J Clin Periodontol ,2010,37(6): 487-493.12 李升,杨明华,董懿. 固齿丸对中、重度牙周炎患者血清骨代谢的影响J.口腔医学，2007，27（7）：372-374.13 Park C H, Abramson Z R, Taba M Jr, et al. Three-dimensional micro-computed tomographic imaging of alveolar bone in experimental bone loss or repairJ. J Periodontol, 2007, 78(2): 273-281.14 杨霞，向学熔，李丛华，等.益气滋肾合剂对牙周炎大鼠外周血TNF-、IL-1含量及牙槽骨微观形态的影响J.第三军医大学学报，2011,33(13):1378-1381. （收稿：2011-07-13；修回：2011-08-19） （编辑 张 维）