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1、龙眼资源遗传多样性的SCoT 和ISSR 分析-论文网论文摘要：本文应用SCoT 和ISSR 标记从DNA 36份龙眼资源和1份龙荔的遗传多样性进行分析。12 对SCoT 引物共扩增出127条带，平均每条引物扩增10.58 条带；15 条ISSR 引物共扩增出117 个条带，平均拉增7.8 条带。UPGMA 聚类结果表明：SCoT 标记和ISSR 标记分别在相似系数0.672和0.685水平上，均可将37份材料分成6 大类群，SCoT 和ISSR 标记都适用于龙眼材料的遗传多样性分析，如果将两种标记的数据进行综合分析，可以缩小单一标记的误差。研究结果为龙眼种质资源的保存和利用提供了重要的依据。
2、论文关键词：龙眼,遗传多样性龙眼(DimocarpuslonganaLour.)是无患子科(Sapindaceae)龙眼属植物，是热带、亚热带重要果树。在我国福建、广东、广西、四川、云南、贵州、海南及台湾等地都有大面积种植。龙眼原产于我国的广西、云南、海南和越南北部,中国2008年Collard和Mackill在水稻上提出一种基于SPAR的新的目的基因分子标记方法，即SCoT分子标记。其具有多态性丰富、操作简单、成本低廉、引物可以通用等特点，并且能有效的产生与性状联系的标记，有利于辅助育种。ISSR分子标记是ZIETKIEWICZE等提出的一项基于微卫星序列的DNA分子标记技术。它结合了RAP
3、D和SSR的优点，具有很好的稳定性和多态性，其产物多态性丰富、模板需要用量少、操作简单等特点。长期以来，研究人员主要运用形态学等植物学特征特性对龙眼资源进行分类研究。虽然近年来国内外在运用分子标记对龙眼资源进行分类研究已有不少报道，但主要局限于栽培品种上。研究实生龙眼资源遗传多样性和亲缘关系的报道较少。为此，本实验借助SCoT和ISSR分子标记技术主要以中越边境中国境内实生龙眼和引入我国的越南、泰国龙眼资源为材料，进行遗传多样性分析和评价。旨在为搞清其遗传多样性程度及其变异情况,为实生龙眼和国外龙眼资源的开发利用打下基础。1材料与方法1.1材料试验于2008年8月-2009年10月在广西作物遗
4、传改良重点实验室进行。供试材料为37份龙眼种质，其中云南10份材料主要采自云南热带作物研究所；越南种质7份和泰国种质6份及四季蜜、龙荔采自广西农业科学院园艺研究所；广西地区种质11份均来源于各材料的原产地（具体见表1）。取样试材为幼嫩叶片，置于液氮中运回实验室放在-80的超低温冰箱中备用。试验试剂10xbuffer(含Mg)、dNTPs、TaqDNA聚合酶等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.2试验方法1.2.1DNA提取与检测参照陈虎等的改良CTAB法提取DNA，用紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，将提取的DNA稀释为30ng·L，于-20冰柜中保存
5、备用。1.2.2引物筛选SCoT引物采用Collard和Mackill公布的36条引物序列和我们课题组自己设计的40条引物，ISSR所用引物参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的100条引物序列，均由上海生物工程合成。在BiometraTprofessionalPCR仪上进行筛选，从所有引物中筛选出扩增产物条带清晰，多态性好的12条SCoT引物和15条ISSR引物引物(表2)，用于所有DNA样品扩增。1.2.3PCR扩增ISSR和SCoT都为20l反应体系，包括DNA(30ng·L)1.0L、10×buffer(含Mg)2.0l、4.0mmol.LdNTP0.5L、30mo
6、l.L引物1l、DNA聚合酶(2U·L)0.5L，加水至20L。ISSR和SCoT采用相同的反应程序：94预变性4min；95变性50S，复性退火温度随引物而定40S，72延伸2min，循环35次；72延伸10min。取5l扩增产物在1.5%的琼脂糖电泳分离，电压为5V.cm,电极缓冲液为1×TAE,电泳结束后用EB染色，在紫外分析仪上观察并照相。1.3数据分析方法根据分子标记的迁移率及其有无，统计所有的二元数据。按条带有或无赋值，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，缺失记为“9”，记录清晰、稳定的扩增带输入计算机。采用NTsys2.10软件计算进行遗传相似性系数计算，
7、在遗传相似系数矩阵的基础上,用UPGMA方法对37份材料进行聚类分析,同时进行主坐标分析检验聚类结果。2结果与分析2.1试验材料指纹图谱的建立从76个SCoT引物中筛选到扩增效果好的12条引物，对供试的37份材料进行PCR扩增与检测，共扩增出127个DNA位点,其中108个位点具有多态性,占总位点的85.04,说明供试的样品遗传多样性比较丰富。每条引物可扩增出S-16条带,平均扩增10.58条带(表2)。产物条带在150-2100bp都有分布。建立37份材料的SCoT指纹图谱，部分引物的扩增结果见图1a。用15对ISSR引物在供试的37份样本进行扩增，共扩增出117个基因位点,每对引物检测出5-12个等位基因,平均7.8个,检测等位基因数最多的是引物UBC810,最少的是引物UBC881。其多态性位点的扩增片段大小为300-2000bp（图1b），多态位点93个,占总条带的79.5%。比较ISSR和SCoT扩增的平均条带数和多态性条带比率,均为SCoT标记多于ISSR分子标记。2.1SCoT标记聚类分析按UPGMA方法构建了亲缘关系树状图（图2a）。