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1、精心整理1.1.1 G i bso nassembl y简介(INTRODUCTION )原理：Gibsonassembly是一种onestep,onepot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60min就可以得到组装好的DNA。装配原理基于 DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切酶(T5exonuclease)，高dsDNA fragments with ov>ilapprgAA + BFully AssernMed DNA保真DNA聚合酶。(Phusionpolymerase)和耐热 DNA连接酶(TaqD
2、NAligase )的共同作用。 首先，T5核酸外切酶消化 DNA片段的链方向是从 5'到3'每个DNA片段分别形成一个单链的 突岀部分，由于着这两个相邻的突岀片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，II 1互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条 DNA单链为模板，沿 3'方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条 DNA分子了。下面是组装的示意图。材料(MATERIALS )试剂(REAGENTS )NAD， H2O， 1MMgCl 2，1
3、MDTT ， 10mMdNTPmix ， 1MTris-HClpH7.5 ， 50%PEG-8000， 2.7mg/mLTagligase，0.85 卩 g/mLT5_ExQ Phusion(1 )x LB 培养基、抗生素(据载体而定)、LB平板(相应抗性)实验前准备(SETUP ) 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。4xisothermalassemblybufferNAD20mgH20300 讥精心整理IMMgCI 2300 讥1MDTT300yL10mMdNTPmix600 讥1MTris-HCIpH7.53mL50%PEG-80003mL加
4、水到7.5mL，每管分500 L存于-20 °C或-80 °C冰箱，够3000个反应2 冷ssemblymix:bestcombination:100reactio n1mL2.7mg/mLTagligase10 讥0.85 卩 g/mLT5_ExO100 讥Phusion(1 x )25 L匕/4x G.A.buffer500 讥加水365 L,存于-20 °C冰箱，有效期1年。； L一一 亍/. J实验步骤(PROCEDURE )1. 设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段， NEB推荐同源片段的长度为15-40bp，同时要求这部分对应的退火温
5、度高于4°C。2. 进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收。或者PCR产物回收试剂盒回收。3. 进行重组反应，以 20卩L反应体系为例：组分加入量lsothermalassemblyMasterMix10 线性化载体 10-100ng（1- 2卩L） 插入片段8-9卩L（3-5 X载体） SterilizedddH 2O 补足至 20 LL50 °C 反应 15-60min4. 反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。针对性建议1. 在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区 域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。2. Gibs on组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性末端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响。3.