无菌检查法药品无菌检查规程.doc

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1、百度文库-让每个人平等地提升自我无菌检查法药品无菌检查规程一、 目的：阐述无菌检查规程。二、适用范围：适用于无菌检查规程。三、责任者：品控部。四、 正文：1概述无菌检查是检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于中国兽药典要求无菌检查的其 它品种是否染有活菌的一种方法。无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作。该检查法根据供试品有无抑菌作用而采用薄膜过滤法或直接接种法两种方式。2仪器、设备和用具无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、 拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控（25 &#

2、177; 2） C及除湿装置。缓冲间及操作室内均设置能达到空气 消毒的紫外灯和照明灯，操作室或工作台应保持正压。2.1.1 无菌室应每周和每次操作前用獅洁尔灭或2%P酚液或其他适宜消毒液擦拭操 作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌半小时。在每次操作完毕，同样 上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。2.1.2 无菌室的无菌程度检查无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约 90mm双碟，在接种室内点燃乙醇灯，在乙醇灯旁，以无菌操作， 将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在3035C培养48小时，取出检查，100

3、级清洁度要求:3个平板上生长的菌落数平均不得超过 1个。无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径w 5卩m的粒数不得超过个/升；空气流量应控制在S;细菌菌 落数平均V 1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。恒温培养箱及可调2025 C的生化培养箱。离心机、显微镜、蒸汽灭菌器、标准 PH比色器&磺酞指示液和溴钾酚蓝指示液）、 恒温烤箱。玻璃器皿 试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管 （1、5、10ml）、注射器（2、5、 10ml）、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。使用过后如与细菌接触，应先灭菌倒出内容物后再清洗

4、，晾干。凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，121C 灭菌30分钟，或置于耐热容器中盖妥160C干热灭菌2小时。2.5.1 移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许棉花，然后放于吸管筒内或牛 皮纸袋内，盖严，灭菌备用。2.5.2 试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞 进管口内2/3之处，用牛皮纸将管口（包括塞子）包扎严，灭菌备用。2.5.3 将注射器、针头（9号、11号、12号）配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、 管和针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严， 用牛皮纸包扎后，灭菌备用。无菌衣、裤、帽、口

5、罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无 菌物品代替。长柄取样匙，放于长的玻璃筒内（或不锈钢长筒内），盖严，干热灭菌备用。微孔滤膜直径50mm孔径卩m购得一批滤膜，需进行孔径大小的测试，一般有三种 方法，选其中一种方法即可。气泡法 先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装 置或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋固 定圈旋紧，在多孔板上加35mm深的水（注意排除气泡）关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶 阀，使压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力 不应小于cm水流量法 将滤膜装于除

6、菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmHg（93kPa下，抽滤已滤 清的水约500ml，计算出每1min的滤速。1995年版中国兽药药典对滤膜的滤速明确规定， 而USP（XXI）规定在700mmHg（93kPa压力下，滤膜直径 47mn;流速5575ml/min。细菌过滤法 常用的细菌为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens CMCC（B）41002），将该 菌的新鲜营养琼脂斜面培养物，接种于营养肉汤培养基中， 3035C培养1820小时，用 无菌氯化钠溶液稀释至103 （约相当于7X 105CFU/m），取此菌液1ml加至50ml无菌氯化 钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，取该滤液

7、5ml接种于营养肉汤培养基40ml中，3035C培 养24小时，应无菌生长。不符合规定的滤膜不得使用。除菌滤器 目前有多种滤器；如STV2型无菌检查薄膜器及封闭式滤器的准备分述如下:2.9.1 STV2型无菌检查薄膜滤器是由除菌过滤器和底座排液架两部分组成。新购置的滤器，需用毛刷将该滤器的各部件用水刷净，除去垢物，用水冲洗45次，蒸馏水冲洗1次。玻璃筒放于玻璃洗涤液或清洁液中过滤，再用水、蒸馏水洗净、晾干。除菌过滤器的装配 在滤器的漏斗部上面置1个橡胶圈，圈上加多孔垫板，在垫板上垫 一个四氯乙烯薄膜垫圈，放上乙浸湿的微孔滤膜 1片，在其上垫一个四氯乙烯薄膜圈及橡胶 圈，安装玻璃筒，套上金属固定

8、架，拧上底部螺母，漏斗底部套上橡皮塞。将已装配妥的滤器放于带盖的瓷盒（或饭盒）中，盖严，外用牛皮纸包扎灭菌备用。底座排液架的排液管口接一耐压橡胶管，将管口用纱布，牛皮纸包扎灭菌备用。该架经 灭菌后放于无菌室内可反复使用。2.9.2 封闭式滤器一般由电脑集菌仪和一次性使用集菌培养器组成。前者放于无菌 操作区台面上。手术镊、手术剪洗净、擦干。用双层纱布将 1把剪和1个镊间隔包扎在一起抽滤瓶一般为10002000ml,用水及蒸馏水洗净，晾干。瓶口用已配有两个玻璃管（一 个通至瓶底，一个短些）的橡皮塞盖紧，短的玻璃管上套一个短耐压橡胶管。抽气口用耐压 橡胶管与空气过滤玻璃器（内充填以棉花）相连，空气过

9、滤玻璃器的另一管口用纱布、牛皮 纸包扎严紧，抽气瓶的全部装置用牛皮纸包扎，灭菌备用。用具的灭菌 将包扎妥的用具（除另有规定外）在（121±）°C蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌。应 置恒温培养箱中烘干。适于高温灭菌的器皿也可采用160C干热灭菌2小时。3试液75%乙醇溶液配制酒精棉球用。碘酊溶液配制碘酒棉球用。无菌氯化钠溶液，分装于试管、三角瓶或玻璃瓶中，瓶口用棉塞、橡胶塞或海绵胶 专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。也可用氯化钠注射液。新洁尔灭（1: 1000）溶液。35%P酚磺溶液或其他适宜消毒溶液。%酚磺

10、酞指示液系列比色液管。溴甲酚蓝指示液系列比色液管。2mol/L盐酸溶液。2mol/L氢氧化钠溶液。无菌的青霉素酶溶液。4培养基一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的PH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。新鲜配制的培养基，应按中国兽药典规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，化 学药品均需用CP试剂规格。421除葡萄糖和指示液外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉或适宜的加热设备中，使微温溶解。用2mol/L氢氧化钠溶液调节PH使其比规定的PH值略高，煮沸， 用棉(纸)浆减压抽滤或以脱脂棉，滤纸等滤材过滤，使培养基澄清。4.2.2 加入葡萄糖和指示液，摇匀，

11、补足水量，调节PH值(比规定的PH值略高，使灭菌后为土，分装，装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。培养基灵敏度检查新购的脱水培养基或采用不同品牌原材料的配制的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。4.3.1 菌种(1)腾黄微球菌Micrococcus luteus CMCC(B)28001(2) 生抱梭菌Clostridium sporogenes CMCC(B)64941(3) 白色念珠菌Candida albicans CMCC(F)980014.3.2 操作4.3.2.1 需气菌、压气菌培养基用腾黄微球菌和生抱梭菌两种菌检查。取藤黄微球菌的营养琼脂斜面新鲜培养物，加无菌氯化钠溶

12、液3ml，制成均匀的菌悬液， 再以无菌R化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10100个菌(CFU并计数。/取生抱梭菌的需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管 内，离心，弃去上清液，取沉淀菌体用无菌 氯化钠溶液制成均匀菌悬液，吸取上述菌悬液， 用无菌氯化钠溶液稀释，照上述方法制成 1ml中含10100个菌并计数。4.322真菌培养基用白色念珠菌检查取白色念珠菌的真菌琼脂斜面新鲜培养物，加无菌氯化钠溶液3 ml，制成均匀的菌悬液，照藤黄微球菌项下方法稀释制成1ml中含10100个菌并计数。4.3.2.3 取藤黄微球菌的营养肉汤，

13、生抱梭菌的需气菌厌气菌培养基的新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物各1ml，用无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成1ml中含10100个菌并计数。4.324 将藤黄微球菌的上述之一的稀释液各 1ml,分别接种至每管装量为9ml的需气 菌、厌气菌培 养基 3管， 生抱梭菌的上述之一的稀释液各 1ml,分别接种至每管装量为12ml 的需气菌、厌气菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养 5天，并逐日 记录结果。4.3.3 结果判断以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。配制的培养基应保存在凉暗处，一般不得超过2周，临用前细菌和真菌培养基分

14、别经3035C和2025C培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。需气菌、厌气菌培养基的指示剂氧化层不得超过培养基深度的1/5，否则经水溶煮沸10分钟，但只限加热一次。无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深 度的1/2。5对照用菌液的制备试验用菌种、菌种的复苏、转种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌 Staphylococcus auteus CMCC (B) 26003的营养琼脂斜面新鲜培养物少许， 接种至需气菌、厌气菌培养基内，在3035°C培养 1618小时，用无菌氯化钠溶液稀释制成

15、每1ml中含1100个菌。 生抱梭菌菌液用接种环取生抱梭菌 Clostridium sporogo nes CMCC(B)64941 的需气 菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同的培养基内，在3035C培养1824小时， 用无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含1100个菌。白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌 Ca ndida albica ns CMCC(F)98001的真菌琼 脂培养基斜面培养物少许，接种至真菌培养基内，在2025C培养24小时，用无菌氯化钠 溶液稀释制成每1ml中含1100个菌。上述制备的菌液，一般当日使用。6抑细菌和抑真菌试验取每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基4

16、管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡 萄球菌、生抱梭菌、白色念珠菌10100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，按规定的 温度培养35日，如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。如加供 试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判 断为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑 菌性后，方可接种至培 养基。7检查法 采用直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品；后者适 用于有抗菌作用的或大容量的供试品。供试品检验量和培养基用量照中国兽药典 2005年版无菌检查法项下表 1或表2、表 3规定，备妥

17、。除供试品外，培养基在移入缓冲间前应先编号，并用獅洁尔灭或酒精棉擦拭瓶（管）外壁，然后连同其他用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，开无菌间紫外灯和 空气过滤装置开关并使其工作在 1小时以上。操作人员用肥皂、水清洗双手，关闭紫外光灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用碘酒棉、 75聽醇棉球擦手、穿戴衣、帽、口罩。将所需物品剥去牛皮纸，移入无菌间，每次试验中 所用物品必须计划好，并有备用物。供试品外部消毒7.3.1 粉针剂、油剂等铝盖压封的橡皮塞小瓶先用 75%醇棉球擦拭外壁及瓶塞，待干， 用灭菌镊子剔去铝盖上的铝质小圆片，过火焰数次。7.3.2 安瓿针剂先用碘酒棉球将安瓿外部擦拭灭菌，待干，用砂轮或

18、灭菌锉轻割安瓿 颈部（便于折开安瓿），再用75%L醇棉球将碘酒擦净，待干。7.3.3 其他供试品容器表面或外包装可参照上述用适当消毒液擦拭或浸没后以无菌的 方式取内容物。直接接种法7.4.1 用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，供试品瓶盖和注 射器针头均应迅速通过火焰数次；当供试品为粉针剂，瓶盖为橡胶塞时，用注射器吸收规定 的溶剂在已消毒好的橡胶塞中心位置刺入小瓶加入溶剂，使溶解，混匀后吸出溶液。如为注 射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液等可直接用注射器吸取药液。按规定或需灭 活的供试品可用灭活剂溶解，将瓶内供试液抽出稀释至规定的浓度。需加入空气加压后便于 抽出的供试

19、品，应用注射器对着火焰抽取空气加入，抽取瓶中液体时，应将供试品倒置并使 针头在液面下。供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药（大包装粉针剂），取样时为缩短暴露 时间，应有两人操作。将经置缓冲间中用 新洁尔灭抹净外壁且经紫外线照射 1小时的大包 装瓶移入操作间（台），除去铝盖，用75聽醇棉擦拭瓶口橡胶塞外壁和瓶口缝隙，待干，戴 好医用消毒手套，在火焰旁小心揭开瓶塞，用灭菌长柄不锈钢药匙取出规定量的样品，置经 1/1000天平称定重量的灭菌试管中，密塞待用，立即盖好大包装瓶塞，用橡皮胶布及时封口， 再用封箱纸包扎瓶口。从上述待无菌检查用的样品试管中，以无菌操作称取一定重量，按各该药品项下的规

20、定 制成溶液，依法接种于上述培养基中。供试品如为外科敷料，取经紫外线照射后的供试品 4个包装，以无菌操作拆包装，于不 同部位分别剪取约100mg或 1 x 3cm的供试品11份，缝合线取最小包装5个，拆开包装，用 灭菌镊子共取11股，接种足以浸没供试品的适量培养基中。供试品如为灭菌医用器具，依照供试品大小，形状不同，用灭菌镊取供试品11个，接种于足以浸没供试品的适量培养基中或用灭菌注射器吸取无菌 氯化钠溶液各40ml，分别冲 洗内壁（输血、输液袋）收集各种冲洗液混合，按薄膜过滤法检查。供试品如为放射性药品，用适当灭菌用具取供试品1瓶（支），接种于装量为的培养基中， 每管接种。7.4.2 操作用

21、适当灭菌用具，取上述制备妥的供试品在近火焰上以右手握拳，小指为 主拨开培养基管的塞子，管口通过火焰，移至火焰下侧，沿着培养基管壁分别接种于需气菌、 厌气菌培养基6管，（其中1管于操作结束后移至接种室接种金黄色葡萄球菌对照菌液1ml），真菌液培养基5管。轻轻摇动使匀。需气菌、厌气菌培养基在 3035°C培养，真菌培养基在 2025 C培养7 日，培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有菌生长）， 并填写检查记录表。如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7日后，不能从外观上判断无微生物生长，可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养，细菌培养 2日，真菌培养

22、3日，观察是否再现浑浊或斜面上有无菌落生长，在接种的同时，取培养液 少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。薄膜过滤法依照所用的薄膜滤器种类不同，操作方法各异，就目前普遍使用的有二：一种为薄膜过滤系统，一种为封闭式过滤器。现分述于下：7.5.1 过滤系统的安装如采用STV2型薄膜过滤器时，拧紧薄膜过滤器的金属底座螺母，将其固定在排液金属 架上，用耐压橡皮管将排液金属架的排液口与抽滤瓶塞中长的玻璃管相连，用螺旋夹拧紧瓶 塞的另一个排气管，本将抽滤瓶的空气过滤装置的玻璃管与真空泵相连。采用其他薄膜过滤 系统时，按其使用说明书进行操作。如采用封闭式过滤器时，将一次性集菌培养器 （依供试品种

23、类不同选择适宜的集菌培养 器如抗生素类采用抗生素专用集菌培养器 ）放于电脑集菌仪的架上，而塑胶软导管放于电脑 集菌仪的蠕动泵的管槽内，其进液导管的双芯针头，插入供试液或冲洗液等容器的塞上。7.5.2 操作7.5.2.1 如供试品有抗菌作用，按中国兽药典2000年版无菌检查法表1或表3规定量取供试品，照直接接种法供试品制备项下，吸取供试液加入无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液至少100ml具塞的瓶中，混匀。采用薄膜过滤器时，通过火焰，将瓶塞打开倒入薄膜滤 器内，立即开动真空泵将供试液抽干，然后用无菌 氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜， 每冲洗一次需将液体抽干，冲洗次数及冲洗液量供试品种类及量而异，

24、至阳性对照菌正常生 长为度，打开抽气瓶塞中的排气管的螺旋夹，将过滤器从排液管架取下，松动底座的螺母， 取下滤膜部分，用灭菌镊将滤膜取出，放入火菌双碟中，用火菌剪刀将滤膜剪成3等份，分别加入需气菌、厌气菌和真菌培基中。采用封闭式过滤器时，将双芯针头插至供试液容器塞 上,开动电脑蠕动泵电源，使药液均匀通过3个一组的集菌培养器，待药液排尽，关闭电源, 将针头取下插至无菌氯化钠溶液或其他适宜的冲洗溶液的容器塞上，冲洗集菌培养器的滤 膜，照上述操作要求，冲洗次数及量以阳性对照管细菌生长为度。关闭电源，将集菌培养器 上排气孔胶帽取下，套于集菌培养器底部的排液管口上；将连接集菌培养器塑胶管之一用夹 子（或止

25、血钳）夹紧，将针头插入含需气菌、厌气菌培养基 200ml的容器塞上，启动电源。使 该种培养基均匀加至两个集菌培养器中，分别用夹子夹紧与其相连的两个塑胶管，同时开通 另一个塑胶管的夹子，将针头插入含真菌培养基100ml的容器塞上，启动电源，待真菌培养基全部移入培养器中，关闭电源，取下集菌培养器，用夹子夹紧塑胶管近端，用剪刀切断塑 胶管远端。7.522将已操作完毕的培养基移出，依供试品特性加入相应的对照菌液1ml（抗线菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生抱梭菌为对照菌；抗真菌药物，以 白色念珠菌为对照菌），按规定温度与时间培养。阳性对照管细菌应培养2448小时，真菌应培养2472小

26、时有菌生长。大容量非抗菌作用的供试品，薄膜过滤后，无须冲洗7.523 每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂、及冲洗液同法操作，作为阴性对照。8结果判断当阳性对照管显浑浊并有细菌生长时，可根据观察所得的结果判定如需气菌、厌气菌及 霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、 厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法复试2次, 除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。无菌检查记录表检品编号/室温湿度检品名称规格、生产单位包装供样单位检验数量、批号收检日期、检验目的检验日期检验依据报告日期供试液制备:1常规法供试品瓶（支）无菌K化钠溶液ml2非水溶性供试品供试品瓶（支）加乳化剂（g或ml）检查法 1.直接接种法2.薄膜过滤法药液浓度冲洗液用量ml培养时间（天）12345678910 111213 14备注需气菌、厌气菌1 / 培养基2 / 3 /4 /5 真菌培养基/1 2 3 4 阳性对照阴性对照结论：本品按中国兽药典2005年版附录（118页）无菌检查法检验，结果符合规定11