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1、.梯度洗脱在色谱方法中，等度洗脱和梯度洗脱是两种常用的方法。在实际应用中，听梯度洗脱应用更加广泛。梯度洗脱可以不同的梯度性状展开。梯度形状是指梯度试验中流动相的组成（B%）随着时间的变化。梯度形状有以下几种：常用的ade，f常用于最后色谱柱清洗阶段。在梯度洗脱过程中，色谱峰以一系列的小步骤流过色谱柱，在每一小步骤中，流动相的组成（%B）都发生细微的变化。梯度分离可看成是大量细微的等度洗脱的结果。在梯度洗脱中的k与等度洗脱中的保留因子k具有同样的意义。tG:梯度时间 ； F：流速 ； Vm：死体积 ； Ø：梯度范围 ； S：分子量在100-500Da的样品S值为4 。公式运用于在梯度中
2、洗脱出来的峰。一：梯度洗脱条件改变的影响1.梯度开始时%B的改变2. 梯度结束时%B的改变3.梯度延时4.仪器的改变5.分段梯度1.梯度开始时%B调整其实的%B通常目的是缩短运行时间。改变起始的%B值，同时也需要改变运行时间才能是K值不发生变化。（tG/Ø不发生变化）下图表示了tG/Ø不发生变化时色谱峰的变化。如上图所示，梯度变化范围都是每分钟2%B，但是（C）所示的方法在分离度分离的前提下，运行时间最短，方法最佳。2最终时%B调整其实的%B同样是缩短运行时间。改变%B值，同时也需要改变运行时间才能是K值不发生变化。（tG/Ø不发生变化）备注：上图中虚线表示梯度。
3、箭头标记了梯度的终点（当它离开色谱柱时）。（a）图中的最终B%是100%。如上图所示，（b）图中的分离度来说，分离在效果没有发生变化，是因为最后的色谱峰（峰9）在梯度结束前流出色谱柱。但是在（c）图中，由于峰7-9在梯度结束后流出，因此峰7-9实际上是在等度条件下流出，结果运行时间增加了。只要最后的色谱峰在梯度结束之前离开色谱柱，只要tG/Ø不发生变化，分离不会有影响，除了减少最后的%B值会减少运行时间。3.梯度延时梯度延时也称为等度停留，指的是梯度开始前存在的一段等度洗脱的时间。从上图可以看出，当前面的色谱峰的洗脱条件接近梯度的起始条件时，梯度延迟对分离的影响就很明显，尤其是当较早
4、洗脱出来的色谱峰之间分离效果不理想的情况下（如c、d）。对于那些靠近梯度终点洗脱出来的色谱峰，他们增加的保留时间等于起始时的梯度延时，二相对保留时间不变化。梯度延时有时用于增加色谱图中较早洗脱出来的色谱峰的分离度。但是当起始比例%B值较高（如c）时，可以降低起始比例%B值同样能达到改善分离度的效果。另一方面，当起始比例%B值接近0时，使用梯度延时是最简便的方法。4.仪器的改变当把梯度的方法一台HPLC系统转到另外一台时，由于两台系统的滞留体积存在差异，会产生不同的分离效果，较早洗脱出来的色谱峰的分离度会发生变化。5.分段梯度分度梯度可用于：每次进样前清洁色谱柱；缩短运行时间；调整选择性来增加色谱图中不同部分的分离度。下图表示了增加色谱图中不同部分的分离度。上图中峰对3-4和峰对14-15是关键的色谱峰对。对于峰3-4来说，梯度较平坦时他们的分离效果比较好，对于峰14-15来说，梯度更陡时他们的分离效果比较好。这时使用分段梯度（图b）。分段梯度一般用于改善分离度，增加分离度的同事增加运行时间。使用分段梯度的前提是，至少有两组关键的色谱峰对分别在色谱图的前段和后端洗脱出来（如峰3-4和峰14-15）否则，第二组色谱峰对会由于起始梯度分段的影响而发生部分迁移，发生迁移后，使用第二次分段梯度不具有太多的照片您固体优势。同时我们可以用增加梯度时间和和改变柱温等方式来增加而分离度。；.