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1、化学发光技术综述化学发光免疫测定CLIA是将抗原与抗体特异性反响与敏感性的化学发光反响相结合而建立的一种免疫检测技术。一原理化学发光免疫测定CLIA属于标记抗体技术的一种，它以化学发 光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反响的物质等标记抗体或抗原， 当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、 催化酶或参与产物作用， 发生氧化复原反响， 反响中释放可见光或者该 反响激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。二特点特异性高、敏感性高、别离简便、快速、试剂无毒、平安稳定、可 自动化。三分类1、从反响原理上， 化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促 反响化学发光。1.1 直接化
2、学发光化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发 光反响，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或 抗体。直接化学发光速度快、 试剂稳定性好， 但灵敏度略低于酶促发光。代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。1.1.1 吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470nm的光，具有很高的 发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶酮是该发光反响体系的发光体。这类化合物的发光为闪光型，参加发光启动试剂后0. 4s 左右发射光强度到达最大，半衰期为 0.9s 左右。特点： 发光反响中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基局部从吖啶环上脱离开来，即未发光
3、局部与发光局部分 离，因而其发光效率根本不受取代基结构的影响。 吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。优点主要有：背景发光低，信噪比高；发光反响干扰因素少； 光释放快速集中、发光效率高、发光强度大； 易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少； 标记物稳定在2-8 C下可保存数月之久。1.1.2. 三联吡啶钌三联吡啶钌 RUbpy32+ 是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺TPA在阳电极外表可同时失去一个电子而发生氧化反响。1.2 酶促反响化学发光 是利用标记酶的催化作用，使发光剂底物发光，这一类需酶催化后发光的发光
4、剂 称为酶促反响发光剂。酶促化学发光灵敏度高，但 速度慢， 酶活性容易受外界影响， 其代表性的发光物质有鲁米诺及其衍 生物、 AMPPD1.2.1. 鲁米诺及其衍生物 HRP激活酶为辣根过氧化物酶HRP，鲁米诺体系的发光根本上为闪光 型且信号弱。但在使用增强剂的情况下，发光的持续时间可延到 30-60min，发光强度至少增加100倍以上。现通常采用的体系是Luminol/H2O2/HRP体系，即用HRP标记抗原或 抗体，以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂，用NaOH+H2O作发光启动试剂，化学发光反响2min后, 光反射强度到达最顶峰； 20min 后，光强度
5、减少 20%。1.2.2. 异鲁米诺( ABEI)新产业的化学发光使用的发光剂，使用的是闪光非酶激活技术，加 入启动液后测试 0.1-3s 时间内的发光强度。1.2.3 AMPPD (AP)激活酶为碱性磷酸酶( AP)AMPP的特性：(1) 在碱性环境下，AMPP的非酶解性的水解程度低，即本底低；(2) 热稳定性好，在pH=7.0的水中，30C时的分解半衰期为142h;(3) 发光为辉光型，波长为470nm在15min时强度到达顶峰， 15-60min 内光信号强度维持一致， 变化很小， 即使在 12h 后仍能测定得 出正确结果；(4) 参加增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵 (BDMQ或BSA等
6、，能明 显增强AP酶解AMPP的发光强度，增强因素达 100-100000倍。现通常采用的体系是 Dioxetane/AP/Enhance System ，即用碱性磷 酸酶(AP)标记抗原或抗体，用(金钢烷)-1 , 2-二氧乙烷或其衍生物作发 光底物，在发光底物中参加增强剂。使用此系统的有美国 DPC公司的Immulite System和Beckman Coulter公司Automated ImmunoassaySystem等，迈瑞的化学发光所使 用的底物根本上属于AMPPD2、从固相载体上，一般分为板式别离和磁珠别离2.1 板式别离技术：将抗原 / 抗体包被在微孔板上， 反响时， 待检物质
7、通过抗原抗体反响 结合于包被板上， 通过洗涤液数次洗涤， 实现结合局部和未结合局部的 别离，后参加底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。此别离技术和酶联免疫分析技术ELISA 致,只是将最后的显色 剂改为发光剂得以实现， 多数手工法检测，及局部半自动仪器使用这种 别离技术，由于抗原抗体结合在反响孔中，反响面积有限，所以为到达 充分反响，孵育时间一般比拟长。常为0.5h2h 。手工法化学发光最常用的发光体系是鲁米诺/H2O2/增强剂，规格和ELISA根本一致，为 48T/96T。2.2 磁珠别离技术超顺磁珠是一种外表带有特定活性基团、大小均匀、 球形、具有超 顺磁性及保护壳的微粒。 超顺
8、磁珠在有外磁场存在时表现出磁力而发生 聚集，无磁场时又失去磁力而分散开来。通过一定的方法可将抗原/抗体等活性物质和磁珠外表的活性基团结合而包被于磁珠上面，检测时，将待检物和包被有抗原/抗体的磁珠在一定条件下孵育，通过抗原抗体反响结合，后通过增加外部磁场，磁 珠产生磁性而聚集在一起，即可进行洗涤，实现结合局部和未结合局部 的别离，最后参加底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。使用磁珠法别离，由于反响时磁珠均匀分布于整个液体中，反响面 积较大，更容易充分反响，故孵育的时间较短。四一些自动化仪器使用的方法原理:工程LIAISONByk-Sa ngtecAxsym雅培Acess贝克曼Immulite2000DPQELECS YS2021罗氏ACS180拜耳固相超顺磁珠塑胶微粒超顺磁珠塑料球，离心超顺磁珠超顺磁珠发光方式异鲁米诺酶促发光离子捕获AP/4-MUP酶促发 光AMPPD酶促发光AMPPD电发光三联吡啶钉吖丫啶酯