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1、测序引物设计方法介绍及注意 事项 粟 燃 忘 硬 贫 透 枣 裂 贸 棉 职 汽 惩 坡 啪 徒 劈 有 棱 敏 灌 臼 哼 悸 趁 柞 沦 蒲 鞭 负 姥 使 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 一、PCR引物设计方法： 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保 守区。 萌 贴 银
2、措 腾 兰 犀 倘 洞 喊 检 养 烂 妈 么 洛 艾 诛 帜 冒 撼 蛤 饭 眺 针 创 合 锗 顷 畔 铝 灰 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 2.引物长度一般在1530碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38， 因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反 应。 滇 秽 扼 麻 酞 蝇 躯 童 视 锈 彻 乱 坊 拱 引 索 遭 脱 驻 桅 搅 茂 琼 耻 裁 养 馁 硫 歌 皿 杉 真 研 究
3、生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 3.引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好 接近72。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引 物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（ meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510。 若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm 为5580，其Tm值最好接近72以
4、使复性条件最佳。 例 阁 沟 汾 翔 惧 峡 彰 焚 次 电 拷 厚 嫉 膨 溃 犁 挖 鹊 鲤 贩 佃 广 初 循 摔 肥 沁 泅 饶 喳 橱 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 4.引物3端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3 位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性 与效率。 搅 激 蔷 吸 负 减 溶 吃 吻 科 赌 妖 锭 贬 牵 盏 抖 留 喀 佳 垮 痒 碘 产 穴 刃 凄 望 美 右 户 勘 研 究 生 实 验
5、测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 5.引物3端不能选择A，最好选择T。 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的 差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能 有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大 大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端 最好选择T。 建 湍 覆 点 大 笆 砒 烟 皑 蜒 廊 赏 锰 咖 逢 菇 具 铅 锗 洼 挣 棱 式 林 萌 某 跪 西 梁 隅 楔 啪 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事
6、项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似 性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降 低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最 好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超 过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发 。 输 丑 疥 睦 匠 茄 苞 胁 表 氰 海 澄 舆 冗 晓 疡 鲸 冰 冈 搞 员 遥 桓 游 裸 听 藐 臂 少 邹 娥 屏 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意
7、 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹 结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻 而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的 互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3端的互补重 叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之 间不能有连续4个碱基的互补。 惧 跌 泽 滋 求 要 顶 篙 萎 抚 获 矩 比 毁 朴 纽 刃 收 贷 谱 投 扣 怔 霖 坷 裕 上 蚕 空 酉 颇 驭 研 究
8、 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽 量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导 致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反 应不能正常进行。 诫 眠 哭 澎 欺 溅 洛 施 帚 阜 刃 垃 帘 吩 波 奥 伎 滑 玛 告 犀 隆 丁 陛 屿 尿 愤 嘛 柯 赋 漫 拖 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍
9、及 注 意 事 项 8.引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低。 G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结 构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应 当选用5端和中间G值相对较高，而3端G值较低（绝对值 不超过9）的引物。引物3端的G值过高，容易在错配位点形 成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的G值可以用 Oligo6软件进行分析） 三 彤 劣 炔 锰 孪 鼻 质 涤 使 飘 忿 沂 瞳 脾 弘 葵 勘 呼 仿 防 夸 耕 宵 块 铲 轿 胀 些 骸 涎 忍 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实
10、 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 9.引物的5 端可以修饰，而3 端不可修饰。 引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响 不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5 端修 饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等； 引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变 序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不 能有形成任何二级结构可能。 忿 川 半 饭 郊 扯 翁 瘤 书 天 挚 迈 摈 景 瘸 七 眺 耪 意 仲 请 去 楞 塘 事 舰 享 民 复 勃 愧 僧 研 究 生 实 验 测
11、 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响 ，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于 选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时， 用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 糖 娘 阵 阐 鞋 赴 推 木 发 暮 艺 阴 肋 据 神
12、分 端 烬 阁 狸 荒 粪 壤 奠 替 郧 拿 话 刨 拦 那 见 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 11.引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互 补性，就可以进行下一步的实验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困 难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作 克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在 这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引 物设计上所要求的参数是不同的。 蛰 昂 惭 淳 儒 痔 静 缉 耪 睁 珠 察 栋 临 炉 呼 捕 旺 津 统 蓉 虚 款 下 祭 望 缕 鞍 浅 歹 惭 阉 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项 研 究 生 实 验 测 序 引 物 设 计 方 法 介 绍 及 注 意 事 项