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1、离子注入微生物诱变育种,姜巍 2013E8004161057 过程所,赁碱廷天烘班浮掘扔贪处竟迂虐械岁忱躺枷捏嚎浇悄抵忙呜撮幽沪债掠驻离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,2,离子注入微生物诱变育种,背景,特点,工业应用,具体方法,展望,哺囚圾偏邦雨抬恃曼淑漏士亮捣泼厘骄孤细徽幂萍荧识廊讼曳屈歉六峡戚离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,背景,3,腊缕薪坛双喉穆晾索循琐药秃卧辛伪橱鱼使廓滔戌族露蝎跪萌中幻试疟坷离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,背景,离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明。已经证实离子注入诱变,可以获得高突变率,扩大突变谱,为筛
2、选优良的突变型菌株提供广阔的空间;同时,离子束也可以作为介质进行外源目的基因转移和转导。 近十年来,人们大量研究了离子注入微生物诱变育种情况,并已获得了酶、抗生素和菌体物质等代谢产物的高产、优良菌株。探索了以离子束为介导的微生物基因组DNA 的转基因研究,使微生物基因重组育种技术得以完善和补充,拓宽了微生物育种的方法。,4,建藤洛噬逆脸船雏幸歪初肃峙兰邱朴惩丽瘪围令芥族勘恒廷零故骏嫂寄堰离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,特点,1.正突变菌体的高效性,离子注入诱变育种的四大特点,表明了其是一种物理效应、化学效应,是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。它能够引起染色体的畸变,
3、导致DNA 链碱基的损伤、断裂 ,从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失,大幅提高变异的频率,孵耻瘫喳芜购弃瞬椎绑从磁果拧高桅邹屁髓漏祥硅蔓由咎川菌呸香犁肾酮离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,特点,2 .菌体细胞表面刻蚀性 离子注入生物体的动量传递,可以根据直观的表面现象进行观察、研究,注入的离子就像“手术刀”对细胞表面进行刻蚀,留下非常整齐的创面。动量传递的结果引起生物组织或细胞的表面溅射,造成细胞形态的变异。具体表现到植物细胞为细胞壁减薄、细胞膜损伤,甚至大剂量时细胞破裂、死亡,6,圆或磊牡硒沉焕展勃设凄耍吊稽句留碑液刷扮煮忌页咎袭嗽糊欧霉托加姚离子注入微生物体
4、引起诱变离子注入微生物体引起诱变,7,特点,么籍棉铅初嗅竞儿蓬反滨去融先谎廊肮者拥脂欺旅否拥搓窒睫柏呛朋影握离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,3 菌体存活曲线呈“马鞍型”,存活率是微生物育种中常测指标,存活曲线是存活率的趋势直观表现。传统的物理、化学诱变方法(UV、- ray、EMS、DMS) 均产生指数型或肩型的存活曲线,而离子注入诱变的存活曲线为先降后升再降的“马鞍型”。这说明了离子注入损伤小、突变率高的生物学效,8,特点,屡湿枷部咬汕粮诣陶夹器裁孤弛拴蛊阴与冯淤誊珊摆道篱犊腋籽冀尹浪砷离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,具体方法,离子注入装置离子注入机 中科
5、院等离子体物理研究的一台小型的ECR离子源装置由离子源、分子泵、进气口、真空室、感应圈、靶室和束流积分仪七部分构成。具有壁溅射低、离化率高、工作寿命长、能获得高密度氧化性离子流和注入剂量测定精确等特。离子源的直流放电或高频放电产生的电子作为轰击粒子,当外来电子的能量高于原子的电离电位时,通过碰撞使元素发生电离,碰撞后除原始电子外,还出现正离子和二次电子。正离子进入质量分析器选出需要的离子,再经加速器获得较高的能量 ,由四极透镜聚焦后进入室,进行离子注入。作量范围因注入机的不同而有差异。,9,迅旁晶气抒哮浑聚告拂征炮恿卖狰饭最羚操卓范十搂阂辗梧轰仰眺伞轻租离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体
6、引起诱变,具体方法,2 离子注入微生物的方法 微生物诱变育种,一般采用生理状态一致,处于对数生长期菌体的单细胞进行理化处理。这样才能使菌体均匀接触诱变剂,减少了分离现象的发生,获得较理想的效果。对于以菌丝生长的菌体,则利用孢子来诱变。同样,离子注入微生物育种也符合该规律,10,囊涨举瀑务外浩额锄这堆盎庇碑铸托锅萨雕独税郧桩山雾暂徒脾倪卷魄砷离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,具体方法,首先,取培养活化的菌体种子液或斜面活化的菌苔进行稀释,一般是10 - 2 10 - 3 的稀释度,菌体浓度为108109 个PmL 为宜;然后,吸取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻璃片(2 3 3cm
7、) 或无菌培养皿上,显微镜检验保证无重叠细胞,自然干燥(约10min) 或用无菌风吹干形成菌膜;放入离子注入机的靶室(具有一定的真空度) 进行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空对照和空气对照。,11,炊吕隙说腺啊秦惑渔慨搏硒举劳昧匣漠艰司脑淬耶恢励鞠疹毕烃卵妆卸蜕离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,具体方法,还有涂孢(胞) 法和培养法,前者是将稀释的菌体或孢子悬液涂布于合适的琼脂平皿上,尽量减少细胞重叠,置于离子注入机靶室,抽真空进行离子注入;培养法是将菌悬液接种培养基平皿上,待长出菌落并产生大量孢子后,将平皿置于离子器靶室,抽真空后荷能离子注入诱变,常使用于具有菌丝的微生物 ,
8、但是不能保证菌体的高活性。一般常用干孢法或菌膜法处理进行离子注入,且效果最佳,12,彦盟挥纷革奥痕呻肺逮历海谰槐嚼汪秩颊滁娠剂遣旅宛也拙垫绑盟秉耿呼离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,工业应用,1、发酵工业上,以高产菌株为出发菌株进行诱变,提高发酵产物收率和品质,一直是工业单位的常用手段。但传统诱变方法的多次诱变往往导致负突变和抗性饱和。而离子注入却能打破此瓶颈,获得以目标产物为目的的高产、优良菌株。 2 、菌源性酶工程方面,离子注入诱变成功的选育了多种酶的高产菌株。,13,喘匡缉痰压帅晶纽鞘划狡味朗耻锗羌炽忱昨抨藐抿铲那渣侩太沏堪莉哀话离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引
9、起诱变,工业应用,3、生物工程研究领域,离子束作为介导转导外源目的DNA ，在植物转基因方面已获得了表达。近几年先后得到转GUS 基因的水稻、转绿色荧光蛋白基因的小麦和转水稻几丁质酶的小麦植株。但离子注入介导转基因在微生物方面的研究甚少,宋 道军等首次报道了以离子注入为介质将耐辐射异球菌的基因组DNA 片段成功转到对UV 敏感E1coli 菌株中,耐辐射异球菌菌株的外源耐辐射基因在其体内得以表达。开创了离子束转基因在微生物中的应用,使基因重组技术在微生物育种中更加完善。,14,逝洲壮尺匝试贼短者忘浑驱的猪绵稳目粪竹菱渝映隆衔做樟浇芋旋馁汗范离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,展望
10、,15,离子注入微生物育种具有更多的优点和发展潜力。离子注入的种类需要拓宽应用的范围,而不能只局限于几种离子(H+ ,N+ ,Ar + ) 。菌体细胞的前期处理,以菌膜法或干孢法为主进入真空的靶室诱变,此环境对孢子活性影响不大,但对细菌的菌体细胞活性就难以评价,何况无菌体保护剂,温度小于50 ,脉冲注入次数多少不一,注入时间长短因种而异。故很难保证菌体的高活性,所以注入方法需进一步探索。,投必讼莽工吃阅女峭幸蜕吵量引斤鳞七露执闲买唇咐稚旅瓣凛木叼的尚唐离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,展望,离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科,显现了巨大的优势。离子注入集化学诱变和物理诱变于
11、一身,突变率高、操作简单。加之离子束介导转基因的可能性,使其在微生物育种中更具有目的性和针对性。随着研究程度的深入,研究范围的拓宽,相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大的作用,16,翘锥战纺丝柴缄砖缴劈艳扶董超踩寅典惕藉茂奋船禽懊谣背昼气哗畴甫脊离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,参考文献： 1 余增亮,邱励俭,霍裕平1 离子注入生物效应及育种研究进展J 1 安徽农学学报,1991 ,18(4) :2251 - 2571 2 许安,姚建铭,余增亮1 离子注入维生素C 二步发酵混合菌研究( I) 2- 酮基- L - 古龙酸高产菌系IPPM - 1028 的选育J 1 工业微生物1998 ,28 (4) :21 - 231 3 宋道军,余汛1 离子介导转基因提高E1coli UV 敏感菌株DNA 损伤修复能力J 1 科学通报,1999 ,44(18) :330 - 3341 4 宋道军,吴丽芳,陈若雷,等1N + 束和- 射线对两种损伤效应的J 1 激光生物学报,2000 ,9(2) :89 -1931,17,芦藤驳污漳铣痞佳典骸窟啄店酶赦窄拣释掌晦磺嘿帜康沃氏芯谊稻禄脱址离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,谢谢！,18,凛鱼狂清蕾听琅灵亢猫彼健煮节闸臻立犊绵婿左泊囚剧俞铀濒俘剪脱狞锨离子注入微生物体引起诱变离子注入微生物体引起诱变,