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1、SODD和Survivin在化疗药物诱导白血病细胞凋亡中的作用 作者：陶红芳, 胡群, 方建林, 刘爱国, 刘双又, 张柳清, 胡迎【摘要】 为了研究死亡结构域沉默子（SODD）、survivin、caspase 3、caspase 8及caspase 9在化疗药物诱导白血病细胞凋亡中的变化，以进一步明确凋亡调控基因的调控机制和寻找药物作用新靶点，采用Annexin V/PI双标记流式细胞术检测化疗药物作用后Jurkat细胞凋亡发生率；采用免疫印迹法分析SODD、caspase 3、caspase 8及caspase 9蛋白表达的变化；采用RTPCR检测survivin mRNA表达的变化；采
2、用免疫组织化学SABC法检测survivin蛋白表达的变化。结果表明： SODD及survivn高表达均抑制肿瘤细胞凋亡，VCR具有时间依赖性特异下调SODD蛋白的功能并能有效诱导Jurkat细胞凋亡，在该凋亡过程中caspase 3、caspase 8酶原呈时间依赖性逐渐被水解剪切，而caspase 9及survivin均无明显变化趋势。结论：SODD参与了VCR诱导白血病细胞凋亡过程,VCR通过下调SODD表达并启动受体配体介导途径诱导Jurkat细胞凋亡，在该过程中线粒体凋亡途径并未被启动。 【关键词】 白血病 SODD；survivin 化疗药物细胞凋亡Effects of SODD
3、and Survivin on Leukemia Cell Apoptosis Induced by Chemotherapeutic Drugs Abstract This study was aimed to investigate the changes of silencer of death domains (SODD), survivin, caspase 3, caspase 8 and caspase 9 in the apoptotic process of human leukemia cells induced by chemotherapeutic drugs in o
4、rder to explore the molecular mechanism of apoptotic modulatory genes and to search for the new target of chemotherapeutic drugs. After Jurkat cells were induced by chemotherapeutic drugs, the translocated phosphatidylserine was labeled with annexin V/PI, and the apoptosis incidence was measured by
5、FCM; The expression changes of SODD, caspase 3, caspase 8 and caspase 9 were determined by Western blot; the changes of survivin mRNA and protein were determined by RTPCR and immunohistochemistry SABC method respectively. The results indicated that high expressions of SODD and survivin could inhibit
6、 apoptotic signaling pathway; VCR downregulated the function of SODD protein and effectively induced the apoptosis of Jurkat cells in a timedependent manner and activates caspase 3 through the death receptormediated activation of caspase 8, in which caspase 9 and survivin were not degraded. It is co
7、ncluded that SODD participates in the apoptotic process induced by VCR which induces the Jurkat cell apoptosis by downregulating expression of SODD protein and priming death receptor pathway. In the apoptotic process, the mitochondrion apoptotic pathway is not trigged. Key words leukemia; SODD; surv
8、ivin; chemotherapeutic drug; apoptosis J Exp Hematol 2007; 15(3):501-505 死亡结构域沉默子(silencer of death domains， SODD)是新近发现的一个凋亡调控基因，特异识别并结合于TNFR胞浆段死亡结构域，具有阻止死亡受体与胞浆凋亡信号蛋白结合继而阻断TNFR凋亡通路的功能 ，是细胞表面死亡受体配体凋亡途径中的主要负调节蛋白。Survivin基因是凋亡抑制蛋白IAP家族的新成员之一,有较强的抗凋亡活性,是线粒体途径中的关键凋亡调控基因。本研究旨在查明SODD、 survivin及凋亡蛋白酶caspas
9、e在白血病细胞凋亡中的作用, 进一步明确凋亡调控基因分子调控机制, 为寻找化疗药物作用新靶点提供依据。 材料 人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞来自于武汉大学细胞保藏中心。注射用硫酸长春新碱（VCR,1毫克/支），注射用盐酸柔红霉素（DNR，20毫克/支），PI/AnnexinVFluos流式双标试剂盒，兔抗人SODD多克隆抗体、兔抗人caspase 3多克隆抗体、兔抗人caspase 8多克隆抗体、兔抗人caspase 9多克隆抗体及兔抗人survivin多克隆抗体，小鼠抗人肌动蛋白（betaactin）单克隆抗体，蛋白markers，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及辣根过氧化物酶标记
10、的羊抗鼠IgG，SABC试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色液，RTPCR试剂盒，各引物由上海生工生物工程合成。 细胞培养 Jurkat细胞置于10 FCS的RPMI 1640培养液，于37 5% CO2相对湿度90培养箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期。 细胞凋亡率的FCM检测 0.1、1和10 g/ml的VCR及0.01、0.1和1 g/ml DNR分别作用于对数生长期的Jurkat细胞12、24和36小时，每样本收获1 × 106个细胞，离心去培养液，用PBS洗涤后，采用AnnexinV/PI双标记的流式细胞术避光室温标记30分钟，上流式细胞仪检测。 SODD、caspase
11、3、caspase 8及caspase 9蛋白表达的Western blot分析 分别收集经VCR 0. l、 1和 10 g/ml 作用 12、24和36小时及DNR 0.01 、0.1 和1 g/ml作用12和36小时的Jurkat细胞，提取细胞总蛋白，变性后每孔50 g进行SDSPAGE电泳，然后电转移至PVDF膜上，用含有5脱脂牛奶的0.1 TBST室温封闭2小时，加一抗4孵育过夜，TBST洗膜10分钟×5次，加HRP连接的羊抗兔或羊抗鼠IgG室温振摇2小时，TBST洗膜10分钟×5次,用新鲜配置的DAB显色液显色。结果用Leica Q Win图像分析软件进行光密度
12、积分值分析，分别用SODD/betaactin、caspase 3/betaactin、caspase 8/betaactin和caspase 9/betaactin光密度的积分值之比以表示SODD、caspase 3、caspase 8和caspase 9的表达水平。实验重复3次。 Survivin mRNA表达的RTPCR检测 按TRIzoL试剂说明书提取经VCR 0.1和10 g/ml作用 12、 24 和36小时的细胞，Unico Uv2000型分光光度仪测量RNA的浓度和纯度。反应引物设计与合成如下，并经GenBank验证： survivin(359 bp)forward prime
13、r 5CTTTCTCAAGGACCACCGCAT3 reserve 5GCACTTTCTTCGCAGTTTCCTC3以GAPDH（788 bp）为内参物， forward 5GGTCGG AGTCAACGGATTTGGTCG3reserve 5CCTCCG ACGCCTGCTTCACCAC3。按试剂盒说明书进行操作。扩增条件为37逆转录1小时，94 预变性5分钟，然后冰上骤冷5 分钟，再94 1分钟，57 1分钟 ，72 1分钟，35个循环， 72充分延伸10分钟。取10 l PCR产物加2 l溴酚蓝后，于2琼脂糖凝胶上电泳，用紫外透射仪观察结果并拍照，结果用 Leica Q Win图像分析软
14、件进行条带光密度积分值分析，以survivin/GAPDH 光密度积分值之比来表示survivin mRNA的表达水平。实验重复3次。 Survivin蛋白表达的免疫组织化学SABC法检测 分别收集VCR 0.1、1和10 g/ml作用24小时细胞，用PBS洗涤，防脱片处理载玻片涂片，4丙酮固定30分钟。余各步骤按SABC试剂盒说明书进行操作。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：采用HPLAS1000病理图文报告分析系统测量细胞染色强度和细胞阳性率，以胞浆含棕黄色颗粒者为survivin阳性，每张玻片随机选取10个视野以分析阳性表达强度与阳性率。 统计学处理 用SPSS 10.0统计软件包
15、中的Bonferroni和精确概率法进行统计学检验，以P<0.05为差异有显著性。 结 果 VCR及DNR对Jurkat细胞的凋亡效应 AnnexinV/PI双标记流式细胞术检测结果表明：不同浓度VCR及DNR均可有效诱导Jurkat细胞凋亡，化疗药物作用后各组细胞凋亡率见表1。从表1可见，VCR随着处理时间的延长，细胞凋亡率呈直线型增加，具有良好的时间依赖性,同时细胞凋亡率也呈现出浓度依赖性，但不如时间依赖明显，提示长春新碱作用肿瘤细胞以时间依赖的方式强于浓度依赖的方式。DNR与VCR相反，其诱导细胞凋亡的方式以浓度依赖性强于时间依赖性。 VCR对SODD蛋白表达的影响 以不同
16、浓度VCR分别处理Jurkat细胞12、24及36小时之后，对SODD蛋白表达的变化进行Western Blot检测。结果显示，随着VCR处理时间及浓度的增加，SODD蛋白带逐渐变细变暗,呈明显时间依赖性（图1）。3次实验结果图像分析发现，SODD/betaactin光密度积分值之比随着VCR作用时间的延长均呈现降低趋势（P<0.05），各组光密度积分值见表2。虽然随着VCR浓度的增加，蛋白表达也有下调趋势，但差异没有统计学意义（P>0.05）。 DNR对SODD蛋白表达的影响 以不同浓度 DNR分别处理Jurkat细胞12及36小时后，用Western Blot检
17、测SODD蛋白表达的变化。3次实验结果图像分析显示，SODD/betaactin光密度积分值之比随着VCR作用时间及浓度的增加均无明显变化趋势（P>0.05）（图2）,数据见表3。这一结果提示SODD并不是DNR作用的靶点。 VCR对survivin mRNA表达的影响 以0.1、 1和10 g/ml VCR分别处理Jurkat细胞12、24及36小时后，用RTPCR技术检测survivin mRNA的表达变化。结果显示，条带无明显变暗变细趋势（图3）。对3次实验的图像分析结果经精确概率法分析发现，各组survivin/GAPDH 光密度积分值之比随着VCR作用时间及浓度的增加均
18、无明 显变化趋势（P>0.05）,数据见表4。这一结果提示VCR不能下调survivin mRNA的表达。 VCR对survivin蛋白表达的影响 以不同浓度 VCR处理Jurkat细胞24小时后，用SABC法检测survivin表达变化。病理图文报告分析系统测量显示，95 Jurkat细胞的survivin表达阳性，棕黄色颗粒定位于Jurkat细胞的细胞质和细胞膜上，胞核也可见少量表达（图4）。统计分析显示，0.1、1及10 g/ml三个作用组的survivin表达阳性率与表达强度差异无显著性（P>0.05）。这提示VCR并不能下调survivin蛋白的表达。 F
19、igure 4. Expression changes of Survivin protein in Jurkat cells induced by different concentratins of VCR. There is no significant difference of survivn mRNA expression in different concentrations of VCR(P >0.05). Caspase 3、8、9在VCR诱导Jurkat细胞凋亡中的变化 Western Blot检测VCR作用Jurkat细胞之后，caspase3、8、9蛋白表
20、达变化的结果显示caspase 8酶原随着VCR处理时间的延长逐渐水解剪切，24小时开始出现活化片段。Caspase 3酶原带随着时间的变化也呈逐渐变细趋势，而caspase 9酶原蛋白带无明显变化，呈现较均一的条带（图5）。3次实验结果的图像分析发现，caspase 3/betaactin及caspase 8/betaactin光密度积分值之比随着VCR作用时间增加而呈现降低趋势（P<0.05）,而caspase 9/betaactin光密度积分值之比随着VCR作用时间及浓度的增加均无明显变化（P>0.05）。 讨 论 SODD是Jiang等1利用酵母双杂交系统在
21、寻找与DR3死亡结构域结合的蛋白时发现的一个死亡结构域抑制因子,它特异识别并结合于TNFR1胞浆段死亡结构域的部位2。在TNFR1介导的凋亡路径中，SODD是一个关键的负调节蛋白，阻止TNFR1凋亡通路呈持续激活状态3。研究表明，高表达的 SODD可抑制TNFR1 介导的细胞凋亡，若抑制胞内SODD表达，则细胞凋亡敏感性恢复，导致凋亡的发生。survivin基因是凋亡抑制蛋白IAP家族的新成员之一4。一般来说，survivin主要表达于胚胎组织和大多数肿瘤组织，而不见于终末分化的成熟组织。本实验研究中95的Jurkat细胞有survivin阳性表达。研究表明，survivin进入细胞核，使CD
22、K4/P21复合物中的P21释放，与线粒体procaspase3结合，抑制其活性，从而阻断效应蛋白激酶，抑制凋亡5。Carter等6在对髓样白血病的研究证实，survivin表达下调，则启动线粒体途径的凋亡通路，诱导敏感细胞凋亡。可见，凋亡调控基因SODD及survivin分别在受体配体凋亡途径及线粒体凋亡途径中起着关键的调控作用，抑制SODD及survivin的表达将促进敏感细胞凋亡。 本研究用Annexin V/PI双标记法证实，VCR及DNR均是通过诱导白血病细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用的。在作用方式上，两种药物有一定的差别，提示临床上VCR化疗可以通过降低剂量延长作用时间达到相同疗效，以减
23、少其化疗负反应，而DNR则对药物浓度的要求高于作用时间的要求。进一步研究显示，SODD及survivin高表达均抑制了Jurkat细胞的凋亡，VCR能呈时间依赖性下调SODD蛋白的表达，有效地诱导细胞凋亡，差异具有统计学意义（P<0.05）。为了检测SODD是否能特异地被VCR下调，我们选用另一常用药物DNR，用不同的浓度处理Jurkat细胞，以同样的方法检测SODD蛋白的表达变化，结果发现SODD并不是DNR的作用靶点。这一结果揭示VCR呈时间依赖特异下调SODD的表达，恢复了死亡受体介导凋亡通路的正常激活机制，诱导白血病细胞凋亡。 细胞内外的许多信号刺激可以诱导细胞发生凋亡，
24、这些信号以及随后的反应途径多种多样，但已公认，凋亡后期的共同途径是凋亡蛋白酶caspase的激活。在受体介导途径中，受体配体聚合后，通过FADD接头蛋白使procaspase 8聚集，聚集后的procaspase 8通过自身和相互之间的切割产生成熟的caspase 8。激活的caspase 8又可以激活下游的效应凋亡蛋白酶如caspase 3等凋亡相关分子，最终导致细胞凋亡7。而对于caspase 9来说，它激活的途径与caspase 8不同，当细胞线粒体受到破坏，释放出细胞色素C，在辅助分子Apaf1的协同作用下，procaspase 9会通过CARD结构之间的相互作用聚集自我激活，启动下游
25、信号的级联反应，诱发凋亡， 此即是线粒体途径介导的凋亡。因而caspase 8 和caspase 9的激活代表了caspase激活的两种方式。 在VCR诱导Jurkat细胞凋亡的早期阶段caspase 3和caspase 8酶原剪切水解不明显，随着作用时间的延长，caspase 3和caspase 8酶原逐渐剪切水解，而caspase 9酶原在VCR作用前后均无明显变化，蛋白带呈现均一条带；且外源性通路的关键调节蛋白SODD在该过程中表达下调明显。以上结果证实VCR诱导Jurkat细胞凋亡是通过了死亡受体介导的caspase 8途径实现的。 进一步采用RTPCR技术及免疫组织化学SABC法检测
26、了VCR对survivin mRNA和蛋白水平的影响，结果发现VCR处理细胞后，survivin 无论在mRNA水平还是在蛋白水平均无明显变化趋势（P>0.05）。此外免疫印迹检测也显示VCR作用后caspase 9酶原无激活表现。这提示VCR诱导Jurkat细胞凋亡并非影响到线粒体凋亡途径中的调控基因survivin。 综上所述，SODD参与到了VCR诱导白血病细胞凋亡的过程，VCR通过下调SODD的表达并启动死亡受体凋亡通路、caspase 8级联凋亡途径而诱导Jurkat细胞的凋亡，在该过程中线粒体凋亡途径并未被启动。【参考文献】 1Jiang Y, Woronicz JD
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