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1、不同中医治法对脑出血大鼠海马线粒体DNA含量的影响作者：张雨星，梁清华，谭勇，陈疆，熊新贵，萧梅芳，曾年菊，范荣【摘要】 目的 观察大鼠脑出血后海马线粒体DNA含量改变及不同中医治法的干预作用，探讨中医最佳治法及方药。方法 用型胶原酶于脑内定位注射诱导大鼠脑出血模型，紫外分光光度计测定脑海马mtDNA水平。结果 145只大鼠全部进入结果分析：mtDNA水平 模型组和中药干预组各时间点均显著低于假手术组（P<0.01），假手术组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），采用不同中医治法后，在第1天平肝熄风汤与大承气汤组的mtDNA含量较模型组增高差异具有统计学
2、意义（P<0.01），在第3、7天，风、火、痰、瘀同治与分治各组的mtDNA含量均较模型组显著增高差异具有统计学意义（P<0.01），而以风、火、痰、瘀同治（平肝熄风汤）组mtDNA又明显高于风、火、痰、瘀分治各组差异具有统计学意义（P<0.01）。神经功能缺损积分：模型组和各中药干预组大鼠于造模后4 h神经功能缺损积分达高峰，随后逐渐下降，至第7天仍高于假手术组和正常组差异具有统计学意义（P<0.01），采用不同中医治法治疗后于第1、3、7天其神经功能缺损积分均低于模型组差异具有统计学意义（P<0.05），于第3、7天平肝
3、熄风汤组积分又比风、火、痰、瘀分治各组明显降低差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 大鼠脑出血后海马线粒体内DNA含量下降，而采用不同中医治法均能阻止mtDNA水平下降，改善神经功能缺损，但以风火痰瘀同治之平肝熄风汤效果最为明显。 【关键词】 脑出血；中医治法；线粒体DNA；大鼠 To determine the change of mitochondrial DNA(mtDNA) content after intracerebral hemorrhage(ICH) in rats and the interventional effects of different tr
4、eatments in TCM and investigate the best therapy and prescription. Methods The experimental ICH models are induced by Type collagenase stereotaxically injected into the globas pallidus. And the Level of hippocampal mtDNA was detected with ultraviolet spectrophotometer. Results In all 145 rats, the m
5、tDNA level in model group and different TCM treatments groups was lower than that in sham operation group at each time points（P<0.01）, but without significance between sham operation group and normal control group（P>0.05）. The mtDNA level in Pinggan xifeng decoction group was higher th
6、an that in model group and other treatment groups at 3 thand 7th days after modeling（P<0.01）. Scores of neurological defects in model group and different interventional groups with Chinese drugs reached the peak 4 hours after modeling, then decreased gradually, but still were more than those
7、in sham operation group and normal group at 7th day（P<0.01）,and the equation scores of Pinggan xifeng decoction group at 3th and 7th day was decreased significantly than other treatment groups with wind, fire, sputum and blood stasis syndromes respectively（P<0.01）. Conclusion Hippocamp
8、al mtDNA content decreases in rats with ICH, but the mtDNA level can be blocked if Chinese drugs therapies, which is effective to improve neurological impairment, can be used, and Pinggan xifeng decoction is the best effective for ICH. intracerebral hemorrhage； Pinggan xifeng decoction; Chinese medi
9、cinal therapy; itochondrial mtDNA; rats 研究表明，线粒体是细胞能量代谢的重要的细胞器，而脑组织是机体内能量代谢最活跃的器官之一，神经元的生存和功能维持都依赖于线粒体充足的能量供应，线粒体DNA（mtDNA）的存在是线粒体别于其他细胞器的一个重要特点，它位于内源性自由基产生的主要场所呼吸链附近，如果没有组蛋白保护易被自由基损伤，损伤后不易被修复。mtDNA损伤后将直接影响到脑细胞的生死存亡及功能恢复。脑出血属中医学“中风”范畴，根据其病机“风、火、痰、瘀”四邪，本实验采用熄风、泻火、化痰、祛瘀及风火痰瘀同治之法治疗脑出血大鼠，观察大鼠海马线粒体DNA水平。
10、 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物 健康SD大鼠145只，雌性72只，雄性73只，清洁级，体质量(250±20)g，动物许可证号：SYXK（湘）2006-0001，由中南大学实验动物中心提供。 1.1.2 药物 镇肝熄风汤、涤痰汤、大承气汤、血府逐瘀汤、平肝熄风汤组方各原生药材按中华人民共和国药典（1995年版）规格从湘雅医院中药房一次性选购，水煎2次取药液，4 保存备用。 1.1.3 仪器与试剂 STOELTING TL-2鼠脑定位仪，美国产；OL YMPUSBX-50光学显微镜，日本产；飞鸽牌微量进样器，上海医用激光仪器厂产；型胶原酶(collagenaseVII)
11、，rhodamine123，Hepes，鱼藤酮，均为Sigma公司产品；Ficoll-400，Pharmacia公司产品。 1.2 方法 1.2.1 造模方法 参照Rosenberg1801-803方法，大鼠经腹腔注射10水合氯醛(400 mgkg)麻醉后，固定于鼠脑立体定位仪上，局部消毒，切开皮肤，暴露颅骨，钻孔，在前囟后1.4 mm，矢状线右侧旁开3.2 mm，垂直进针5.6 mm，定位于苍白球，模型组和各中药干预组以微量进样器缓慢注入含0.4 U VII型胶原酶的灭菌生理盐水2 mL，留针5 min，缓慢拔出针头，缝合皮肤。假手术组以同样方法在此位点注入灭菌生理盐水2 L，正常对照组不干
12、预。 1.2.2 动物分组与及给药方法 145只大鼠随机分为8组，正常对照组5只，不做手术；假手术组20只(苍白球注入生理盐水)；模型组20只(苍白球注射型胶原酶04 U)；治疗组100只，苍白球注入型胶原酶0.4 U，随机分为镇肝熄风汤组20只，大承气汤组20只，涤痰汤组20只，血府逐淤汤20只，平肝熄风汤20只，除正常组外,其余7组各设4个时间点:4 h，1、3、7 d,每个时间点5只大鼠。治疗组于造模动物清醒后分别开始灌服中药,镇肝熄风汤药液浓度为2.38 g/mL,用药量按人与动物体表面积换算(为临床70 kg成人用量的3倍,相当于生药9.62 g/（kg·d)、平肝熄风汤药
13、液浓度为2.84 g/mL,用药量按体表面积换算(为临床70 kg成人用量的3倍,相当于生药51.68 g/（kg·d)、涤痰汤药液浓度为0.81 g/mL用药量按体表面积换算(为临床70 kg成人用量的3倍,相当于生药2.67 g/（kg·d)、大承气汤配成127.28 g/mL混悬液,用药量按体表面积换算(为临床70 kg成人用量的3倍,相当于生药2.31 g/（kg·d)、血府逐瘀汤浓度为0.81 g/mL，用药量按体表面积换算(为临床70 kg成人量的3倍,相当于生药19.39 g/（kg·d)，每天上下午各1次，每次2 mL。正常组、假手术组、
14、模型组给予灭菌生理盐水灌服,灌胃时间及液体量同治疗组,动物均任其自由取水饮食,保持室温2030 。 1.2.3 神经经损伤症状评分 根据文献1804-807介绍方法分别从向出血侧旋转，前爪抓力，爬竿能力3个方面评定。向出血侧旋转的程度评分为：0分为不旋转，1分稍向出血侧偏斜，2分明显向出血侧偏斜，3分接近走圆圈，4分为自发性旋转，追尾现象。将大鼠前爪置于14英寸高的盒边，检测前爪抓力，偏瘫侧前肢抓力评分：0分为抓牢而不掉下，1分为能抓住，时间较长，2分为能抓住，时间较短，3分为勉强抓住，4分为不能抓住。将每只大鼠置于一长60 cm，直径3 cm木棍上，爬竿评分为：轻松通过得0分，能通过，但稍有
15、点不平衡得1分，勉强通过得2分，可爬行，不能通过得3分，不能爬行得4分。以此计算总的损伤得分。 1.2.4 脑线粒体制备2 大鼠断头取脑，分离患侧海马，称重后按19(mv)比例加入匀浆液(蔗糖250 mmolL，EDTA 0.5 mmolL，Tris-HCl 10 mmolL，pH 740)手动匀浆，2 000 g，离心3 min，取上清液置于12 000 g，离心8 min，将沉淀仔细悬于Ficoll梯度中，11 500 g，离心30 min，去上清液，匀浆液洗沉淀后，悬于1.0 mL，冰冷匀浆液中，再以12 000 g，离心8 min，所得沉淀即为线粒体，(以上操作均于4 进行)，线粒体以
16、匀浆液悬浮，以Lowry法测定蛋白含量。 1.2.5 线粒体DNA含量的测定3 上述线粒体悬液200 L，冰浴，加入400 L的NS液（0.2 mmol/L NaOH、10 g/LSDS）用力振动，放置-70 2 min。加入300 L 3 mmol/L乙酸钾，冰浴5 min，4 离1 000 g，10 min。取750 L液加入450 L异丙醇，轻晃，-70 min，4 离心1 000 g，沉淀物为mtDNA。沉淀物用体积分数为0.7乙醇漂洗，真空干燥。将mtDNA溶于100 L TE溶液（10 mmol/L Tris-HCL，pH 8.0，1 mmol/L乙二胺乙四酸），加入RNasel(
17、100 g/L)去除RNA。用等体积酚抽提mtDNA2次，再加入含150 mmol/L NaCl的乙醇沉淀，沉淀物(mtDNA)真空干燥后溶解在50 L TE中。双管测定A260，A280值，计算mtDNA水平。 1.2.6 指标检测 各组大鼠造模后不同时间点神经症状积分和大鼠海马线粒体内DNA水平。 1.3 统计学处理 所有实验数据均以±表示，各组间比较采用方差分析及t检验。 2 结果 2.1 神经缺损症状积分 大鼠麻醉清醒后观察其行为改变，型胶原酶造模后模型组及各中药干预组大鼠均表现为活动迟缓，易激惹，不同程度的偏瘫，追尾现象及爬行困难，前爪抓力下降，爬杆困难等(见表1)。假手术
18、组及正常组未出现上述神经缺损症状，且取脑时未见脑内血肿形成。在型胶原酶造模后4 h模型组及各中药治疗组大鼠神经缺损积分达高峰，4 h后各时间点造模大鼠积分逐渐下降，采用不同中医治法治疗后于第1、3、7天其神经功能缺损积分均低于模型组（P<0.05），且平肝熄风汤治疗组在第3、7天两个时间点，神经缺损症状积分明显低于模型组及其余各中药治疗组，差异具有统计学意义(P<005，表1)。 2.2 各组大鼠术后不同时间点mtDNA水平比较 大鼠脑出血后，4 h开始血肿周围组织线粒体内DNA水平持续下降，低于假手术组，差异具有统计学意义（P<0.01）；假手术组与
19、正常对照组无统计学意义（P>0.05）；各中药治疗组中，平肝熄风汤组mtDNA水平在第3、7 d明显高于其他各中药治疗组及模型组，差异具有统计学意义（P<0.01,见表2）。经不同中医治疗后，于造模后1 d，平肝熄风汤组与大承气汤组的mtDNA含量均较模型组明显增高，差异具有统计学意义（P<0.01）；而风、火、痰、瘀同治（平肝熄风汤）组mtDNA含量又明显高于其它分治各组，差异具有统计学意义（P<0.01）。 3 讨论 线粒体是真核细胞内一种重要而独特的细胞器，是细胞内的动力站，通过氧化磷酸化作用进行能量转换，提供细胞进行各种生命活动所
20、需的能量,有细胞“动力工厂”(power plant)之称。它的功能的维持是细胞生存的基本条件,主宰着细胞的生死存亡4，5。研究发现，线粒体内包含一些与细胞凋亡有密切关系的物质，如细胞色素C(CytC)、凋亡诱导因子(AIF)、Ca2+和活性氧自由基(ROS)等。mtDNA作为细胞核外遗传物质，没有组蛋白保护，呈裸露状态，易受侵害，又缺乏有效的修复系统，而且为不对称复制，复制频率和次数高，因此容易受损伤。而对于mtDNA的研究使人们认识到，mtDNA在许多疾病的发生、发展中都有着举足轻重的作用。目前的研究已经表明，一些心脑血管及神经系统疾病与mtDNA 突变有密切联系，如原发性心肌病、心力衰竭
21、、冠心病、高血压、帕金森病等6。在缺血缺氧引发的一系列损伤过程中，mtDNA是最易受损的细胞成分之一。在二氯化钴模拟的缺氧模型中，mtDNA是氧化损伤的最初目标7。脑出血是一种特殊类型的脑缺血，同样有缺血缺氧引发的病理改变及mtDNA的损伤。 本实验发现，在大鼠脑出血后4 h，mtDNA含量下降，且呈持续状态。至第7天，各中药治疗组及模型组仍明显低于假手术组（P<0.01），假手术组与正常对照组无差别（P>0.05）。脑出血后mtDNA含量下降的因素有多种，主要因素有自由基及一氧化氮（NO）产生增多、ATP生成减少。mtDNA的损伤导致ATP水平下降，当低于某个阈值
22、时，对ATP需求量大的器官，如中枢神经系统就会出现细胞变性与死亡8，造成神经元损伤。本实验采用镇肝熄风汤、大承气汤、血府逐瘀汤、涤痰汤、平肝熄风汤对模型大鼠进行治疗，结果显示，治疗后各时间点mtDNA含量均较模型组高，在第3、7天，平肝熄风汤组mtDNA含量明显高于模型组及其它各中药治疗组，表明不同中医治法均能阻止mtDNA水平下降，维持神经元的正常功能，以平肝熄风汤效果最明显。这与以往对平肝熄风汤的临床研究相符合。脑出血急性期，临床表现虽有风、火、痰、瘀偏盛，辨证以风、火、痰、瘀分治，其疗效不如风、火、痰、瘀同治，提示急性脑出血病机为风、火、痰、瘀夹杂致病。采用风、火、痰、瘀同治之平肝熄风汤
23、治疗，在临床上取得了显著疗效9。 脑出血属中医学的“内中风”、“卒中”范畴。对其病因病机的认识，唐宋以前多以“内虚邪中”立论，认为中风是真气不足，脉络空虚，风邪乘虚侵袭所致；金元时代起，突出以“内风”立论，刘河间提出“心火暴盛”，李东垣认为“正气自虚”，朱丹溪力主“湿痰生热”，张景岳则提倡“内伤积损”之说，叶天士以“肝肾阴虚，水不涵木，肝阳偏亢，内风时起”立论，王清任创立“气虚血瘀”。晚清张山雷，张锡纯认为中风的发生主要在于“肝阳化风、气血并逆、直冲犯脑”。综合各家学说，急性期中风病机不外乎风、火、痰、瘀等4邪，多年来研究表明，针对以上“四邪”治疗脑出血，在临床研究中取得了较好疗效10-13。
24、本实验根据此病因病机，分别采用平肝熄风、通腑泻火、涤痰开窍、活血祛瘀及风火痰瘀同治之法，治疗脑出血模型大鼠，结果均能阻止线粒体DNA水平下降，维护线粒体的功能，对脑出血神经损伤发挥保护作用，但以风、火、痰、瘀同治方药平肝熄风汤效果最佳。这一研究将为治疗急性脑出血的临床应用提供科学依据。【参考文献】 1 Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in ratsJ. Stroke 1990:21(5).2 项 平，高国全，姚志彬.大鼠脑线粒体DNA提取方法J.解剖
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