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1、RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响 作者：郝林,郑骏年,李望,杨文发,刘俊杰,温儒民,陈家存,孙晓青【摘要】 目的 探讨针对人端粒酶RNA（hTR）及其催化亚基（hTERT）的小干扰RNA（siRNA）对肾癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响。方法 将hTRsiRNA、hTERTsiRNA（100nmol/L）单独或联合转染人肾癌7860细胞，采用RTPCR法检测hTR、hTERT mRNA表达，TRAPELISA法检测端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖，免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果 （1）hTRsiRNA可显著降低7860细胞hTR mRNA表达(P<0.
2、01)，hTERTsiRNA可显著降低hTERT mRNA表达(P<0.01)，但彼此互不影响。（2）二者均能显著抑制端粒酶活性(P<0.01，P<0.01)，并增加7860细胞增殖抑制率及凋亡细胞阳性率 (P<0.01，P<0.01)。二者联合应用与单独应用差异亦无显著性(P>0.05)。结论 hTR、hTERT siRNA通过抑制各自基因表达，抑制人肾癌细胞端粒酶活性，进而抑制增殖、促进凋亡。 【关键词】 肾癌；小干扰RNA；端粒酶RNA；端粒酶逆转录酶of Proliferation and Induct
3、ion of ApoptosisKey words：Renal neoplasm；Small interfering RNA； Human telomerase RNA；Human telomerase reverse transcriptase0 引言 端粒酶被激活导致肿瘤细胞无限增殖，抑制端粒酶活性能使肿瘤细胞无法合成端粒而凋亡，因此是肿瘤治疗的理想靶点1。端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR)及端粒酶逆转录酶(hTERT)组成。端粒酶以hTR为模板合成端粒DNA，hTERT则是催化这一反应的唯一限速酶。RNA干扰能特异、高效阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具。我们应用RNA干扰技
4、术阻抑hTR、hTERT表达,观察其对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响。1材料与方法1.1材料 人肾癌透明细胞株7860由本室保存。hTRsiRNA、hTERTsiRNA、阴性对照siRNA、siRNA转染试剂盒为美国Ambion公司产品。总RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒为美国Promega公司产品。TRAPELISA端粒酶活性检测试剂盒购自Roche公司。原位末端凋亡检测试剂盒购自Santa Cruz公司。1.2方法1.2.1siRNA的设计、合成 由Ambition公司设计、合成针对人端粒酶hTR序列及hTERT基因显性失活突变体区（NM003219，碱基序列位置21822200）
5、的siRNA。hTR序列如下:正义链： 5'UUGUCUAACCCUAACUGAGtt 3'，反义链3'ttAACAGAUUGGGAUUGACUC5'。hTERT序列如下:正义链5'CAAGGUGGAUGUGACGGGCtt3'.反义链3'ttGUUCCACCUACACUGCCCG5'。经基因库检索确认与hTR、hTERT以外的基因序列无同源性。1.2.2细胞培养及转染 7860细胞于含10%FCS的RPMI1640中常规培养48h，按转染试剂盒说明将hTRsiRNA、hTERTsiRNA调整到终浓度为100 nmol/L，单独或
6、联合加入培养细胞内,另以生理盐水(空白对照)、脂质体、阴性对照siRNA作对照。培养24h后检测hTR/hTERT mRNA表达及端粒酶活性，72h后检测细胞增殖及凋亡。1.2.3RTPCR 提取总RNA，RTPCR试剂盒一步法行RTPCR反应。hTR上、下游引物序列如下：5'CTGGGAGGGGTGGTGGCCATTT3'， 5'CGAACGGGCCAGCAGCTGACAT3'。hTERT引物：5'GCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAA3'，5'AATCATCCACCAAACGCAGGAGC3'。以GADPH基因作为内参
7、照。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并扫描分析，以hTR、hTERT/GADPH表达水平行半定量分析。1.2.4端粒酶活性的测定 采用端粒重复序列扩增酶联免疫吸附(TRAPELISA) 法进行检测,根据A=A450A690计算端粒酶活性,并计算与空白对照组比值。具体步骤按说明书进行。1.2.5MTT法检测细胞增殖 处理后7860细胞加入MTT10l/孔(5mg/ml)，继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜100l/孔，溶解甲瓒紫结晶，酶标仪570nm波长处测定吸光度A值，计算抑制率。1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡 7860细胞于玻片上固定，洗片后与Triton100共同孵育2mi
8、n，滴加TUNEL反应混合液，在湿盒中37孵化1h，PBS洗3次，二氨基联苯染色，洗片后封片。高倍镜下随机计数5个视野，细胞核呈黄褐色即为阳性，计算阳性细胞百分比。2结果2.1siRNA对7860细胞hTR、hTERT mRNA表达的影响 与阴性siRNA对照组比较，hTRsiRNA组hTR mRNA水平明显下调（P0.01），hTERT mRNA水平无明显变化（P>0.05）。hTERTsiRNA组hTERT mRNA水平明显下调（P0.01），hTR mRNA水平无明显变化（P>0.05）,见表1。表1 hTRsiRNA、hTERTsiRNA对肾癌7860细胞h
9、TR、hTERT mRNA表达的影响（略）注：与阴性siRNA组比较，P0.05，*P0.012.2siRNA对7860细胞端粒酶活性的影响 hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明显抑制端粒酶活性（P0.01），但二者比较差异无显著性（P>0.05）。联用组与单用组比较差异无显著性（P>0.05）,见表2。表2hTRsiRNA、hTERTsiRNA对肾癌7860细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响（略）注：与阴性siRNA组比较，P0.01;三组之间两两比较，P0.052.3siRNA对7860细胞增殖的影响 hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明显抑制78
10、60细胞增殖，二者比较差异无显著性（P>0.05）。联用组与单用组比较差异无显著性（P>0.05）,见表2。2.4siRNA对7860细胞凋亡的影响 hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明显促进7860细胞凋亡，二者比较差异无显著性（P>0.05）。联用组与单用组比较差异无显著性（P>0.05）,见表2。3讨论 端粒位于线性染色体末端，细胞每分裂一次端粒序列缩短50200bp,当缩短至临界长度时细胞凋亡2。端粒酶是催化合成并维持端粒长度的一种核糖核蛋白,由端粒酶RNA（hTR）、端粒酶催化亚基（hTERT）组成，它能以hTR为模板，
11、在hTERT催化下合成端粒,以弥补缩短的端粒3。癌细胞由于端粒酶的激活使染色体端粒维持在一定长度，一方面使细胞获得永生，另一方面使细胞周期缩短、生长变快3。研究证实针对hTR、hTERT的反义核酸能够通过抑制端粒酶活性，抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡1,4。Kanaya等5报道hTR、hTERT在肾癌组织的检出率分别为80%、86%,且其表达与端粒酶活性呈正相关，而正常肾组织无hTERT表达，因此hTR、hTERT是肾癌基因治疗的有效靶点。 RNA干扰是由小片断双链RNA（siRNA）介导的转录后基因沉默技术。siRNA进入细胞后与RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合，并在RISC作用下特异
12、性降解靶基因mRNA，其效率比单链反义RNA强100倍6，因此siRNA可在体内外抑制癌基因表达，并抑制肿瘤生长7。本研究发现siRNA可抑制肾癌细胞hTR、hTERT基因表达，且具有高度特异性。hTR、hTERT表达抑制后，肾癌细胞端粒酶活性降低。二者抑制端粒酶活性作用相仿，联用亦不能增强抑制作用。我们的研究结果与Kosciolek在结肠癌、宫颈癌细胞中获得的结果一致8。 本研究还发现hTRsiRNA与hTERTsiRNA具有相似的抑制肾癌细胞增殖、促进凋亡作用，联合应用也不能增加其作用。肿瘤细胞端粒酶活性下降后，通常需要数周时间，肿瘤细胞经过数代分裂使端粒缩短至临界值后才能凋亡9。但如果肿
13、瘤细胞的端粒加帽延长功能具有缺陷，肿瘤细胞也能立即出现增殖抑制、凋亡增加10。本研究siRNA处理后72h细胞即出现增殖抑制、凋亡增加，可能与7860细胞端粒加帽延长功能缺陷有关。【参考文献】 1许宁，赵忠文，石爱平，等.端粒酶反义寡核苷酸对肾癌细胞端粒酶活性及其体外增殖的影响J.中华泌尿外科杂志，2000,21(6):331333.2Richard CA,Homagoun V,Christopher P.Telomeres length predicts replicative capacity of human fibroblastsJ.Proc Natl Acad Sci USA,199
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