样本采集与处理.doc

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1、样本采集与处理样本采集样本采集要注意的重点是，所采集的临床标本 一定要正确和采集的时间合适，并注意采用正确 的标本容器，采集的方法程序对有些临床标本非 常重要。在疾病发展过程中，标本采集过早或过 晚都可能会给出假阴性结果。尽可能在最短的时间内完成样本的米集 (应 该保证30min内完成，不适当的处理时间将直接 影响和干扰研究的结果)，应尽快降低所采集组 织样本的温度。肿瘤组织标本的采集和处理应遵循严格的 生物安全处理规范，也可根据研究者所提出的特 殊要求，按照对方提供的操作模式进行相关处 理。(1)患者入院后进行生物安全性检查。检 测HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情况。HIV 感染患者不

2、列为采集对象。HBV及HCV感染者， 须在样本上明确注明。(3)组织标本取材时间 肿瘤外科手术后， 标本离体30min内。(4)标本米集每种肿瘤主要采集3类生物样本，并要保证这些样本的质量和数量能够用于 DNA RNA和蛋白质提取及满足相关的实验分析1）新鲜组织（包括手术和活检组织）实体组织样本采集包括外科手术切除的或 活检和尸检得到的正常、良性和恶性肿瘤组 织。手术结束后，在临床肿瘤病理专家的指 导下，在不影响病理诊断取材需要的前提 下，采集组织样本。A。标本取材部位：肿瘤组织、癌旁组织（癌 组织旁1cm和正常组织（癌组织旁5cm以外 或最远处）。a）临床诊断明确，未经放疗和化疗的手术切 除

3、标本，在病理医生指导下取材。b）尽量保证癌组织没有坏死（有坏死的标本 很难提取高质量的RNA和蛋白）。c）配对"癌旁组织"，选择距离癌灶边缘3 cn 范围内的组织样本，配对“正常组织”，要选 择距癌灶边缘5 CM以上或距离癌灶边缘最远段（或手术切缘处）取组织样本，应注明距离。等，“癌旁组织”“正常组织”应取相应部位的“粘膜组织”样本 d） 在保障病理学检测所需标本的前提下，尽 量提供足量的肿瘤和癌旁正常组织，一般不少 于200mg或10E7细胞。e）手术切除的组织样本必须迅速置于液氮中， 然后保存于液氮罐或-80 C冰箱，这一过程尽 量在手术标本离体后30分钟内完成。f）其

4、中一块组织可用OCT处理后冻存，可用 于形态学观察和显微切割。（OCT（Optimal Cutti ng Temperature） 包埋剂 是一种常用的固形剂。用其包埋组织进行速冻 后，能与组织固定成形，有利于保存组织结构 完整性，便于其形态结构的分析）B。过程：使用数码相机拍摄标本外观后， 将标本切成小块（直径0.5cm x 0.5cm，厚度<0.5cm）,为减少处理时间，标本不应切得太小， 然后放入冻存管中，标记后放入标本盒中，盒盖 上附有记录标本编号、采集时间及标本类型的标 签。每例病人样本保存3-5份冻存管标本。每份 组织重量原则上不低于2g。2）石蜡包埋组织a）中性福尔马林固定

5、手术切除标本按病理学操作规范进行取材b）取材部位包括癌灶，以及癌灶周围 3cm以 内的癌旁组织，35cm的近癌组织 和5cm以 外的远癌组织或距癌灶边缘最远段分别取 2-3 块。取材尽量以癌灶为中心水平向两侧取材，尽量保证足够大的组织样本。取材应该以“远 癌-近癌-癌灶"的顺序。癌灶处取材包括癌与 正常组织的交界及肿瘤浸润最深处。所有取材 的组织块应标明取材部位。c）采集完整的临床病理和随访资料，其中治 疗过程和生存期的资料最为关键。3）血液（包括血浆、血清）始终遵循标准防护方法，所有操作均要戴手 套。在抽取静脉血时，应当使用一次性的安全 真空采血管取代传统的针头和注射器，因为这 样

6、可以使血液直接采集到带塞的运输管和（或）培养管中。用完后自动废弃针头。每例 不低于全血10mL分装两份。以全血作为待 测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用 EDTA-K3或枸橼酸钠，不可使用肝素。全血样 本如用于DNA提取检测，可4 C下短期保存，如用于RNA佥测，则应在取血后尽快提取RNAa）及时采集入组病例的外周血标本，初诊患者3-5 ml，EDTA抗凝，30OOrpm离心，血浆和 有形成份（白细胞成分）分别用统一质量标准 的容器保存（尽量在2h内完成血浆的分离工 作）。b）特殊病例要保存治疗前后的外周血标本各5 ml （血浆或血清）。c）采集的血浆或血清样本在无菌条件下分装， 0.5

7、-1 mL/每管，用螺纹口管，-80 C保存。d）手术前后血浆或血清，明确临床诊断后在 术前取血，术后第14天或出院前取血。e）化疗前后血浆或血清采集按照临床试验操 作规程和技术标准制定。f）非癌患者/正常对照血浆或血清样本，选择 年龄、性别与实验组相匹配的非癌患者为对 象。2、根据研究课题的具体目标，所采集的生 物样本主要用于3类实验研究：1）测试样本：主要用于基因、蛋白表达谱 建立，基因组测序分析，样本质量优先。主要考虑的因素为肿瘤分型和分类，每一类型要达到统 计学小样本数目。2）验证样本：主要用于标志基因变异的确认'进行 RT-PCRWBIHC/ISH、突变检测、ELISA 的实

8、验分析。主要考虑的因素为肿瘤分型、分类 和分期，包括不同阶段癌前病变组织样本， 病理 学诊断要明确，每一类型要保障统计学大样本数 目。3）分型样本：主要用于肿瘤标志基因或蛋 白的大样本、多中心临床验证，包括IHC, ELISA, REAL TIME RT/PCR基因/蛋白临床检测芯片的 分析。临床随访资料和生存期为考虑的主要因 素，每一类型要保障符合多中心、 大样本的统计 学要求。米样及运输容器标本的采集材料如棉签、拭子等均应为一次 性使用，采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂 材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全 血、和血浆样本，首先要抗凝，抗凝剂的选择很 重要。一般应使用EDTA和构橼

9、酸盐作为抗凝剂， 肝素因其对PCRT增有很强的抑制作用，且在后 面的核酸提取中很难去除，故应尽量避免使用。 此外，标本运输中的保存液对其有稀释作用， 因 此应考虑稀释对测定的影响。现已有厂商专门有 用于PCR佥测标本采集的无核酸酶容器供应。样本采集中的防污染样本采集最好采用一次性无菌及无核酸酶的材 料，不用处理便可直接使用，采集中要特别注意 污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液 等。如使用玻璃器皿，必须经 0.1%DEP（水处理 后高压，以使可能存在的RNase失活，并降解对 PCF有抑制作用的DEPC采样质量的评价血清（浆）标本可观察标本是否溶血、脂血及 其程度，并明确这种情况是否会对

10、相应的检测造 成影响。总而言之，标本的收集及适当的预处理，对用 于PCF测定的核酸模板的成功提取，具有决定性 作用。附件5 肿瘤样本采集的基本技术标准（适 用于部分小量生物样本提供单位使用）1. 所有入组病例要按要求采集肿瘤组织标 本、血液和具有临床检测意义的体液。2. 送检肿瘤组织和血液标本最好在未经放 疗和化疗前采集。3. 送检肿瘤标本必须病理诊断明确，尽量 保证有足够多的癌细胞（50%上为好）。4. 癌组织没有坏死。（有坏死的标本很难提 取高质量的RNA和蛋白）5. 在保障病理学检测所需标本的前提下，尽量提供足量的肿瘤标本和癌旁正常组织，至少 1-2 克。6. 手术标本必须迅速置于液氮中

11、，然后保存 于-80 C或-130 C冰箱，这一过程要求在手术离 体后30分钟内完成）。7. 如果不能提供与病理学检测平行的活检 组织标本，至少提供5-10张组织切片。8. 要提供与病理学检测平行的石腊组织块或福尔马林固定组织标本，或至少提供5-10张组织切片。9. 提供肿瘤脱落细胞涂片或组织印片 5-10 张10. 及时采集入组病例的外周血标本，初诊患者5-10 ml，EDTA抗凝，3000rpm离心，血 浆和有形成份分别用统一质量标准的容器保存。 特殊病例要保存治疗前后的外周血标本各5 ml（血浆）。附件8 （供参与国际合作的课题组参考） 国际肿瘤基因组协作研究（ICGC肿瘤组织样本 质量

12、标准三、样本质量标准及操作规范：1. 在ICGC计划实施一开始，就应保证所 采用的肿瘤类型和样本的高度均一性。2. 在ICGC计划实施的一开始，应保证使 用的肿瘤样本未经过任何治疗，即原发灶，不要 复发的肿瘤组织样本，解剖学上为单一起源，并 能代表单一组织学类型或亚型，（最好为同一组 织病理学级别）。3. 采用样本中的肿瘤细胞要在80姬上, 坏死细胞或正常细胞（炎性细胞，免疫细胞，间质 细胞或癌前病变细胞）应少于20%某些种类的 肿瘤,可能需要适当降低以上标准，但是如果肿 瘤细胞数低于60%寸,就需要考虑利用一些物理 的方法进行富集。4. 需要备有组织学鉴定的文档和图像资料 能够提供给从事特定

13、肿瘤的研究者参考。要明确评估组织的等级1）坏死;2）碎片;3）炎性组织;4） 纤维化；7. 原则上,每例样本需要200 mg实体瘤组 织或10E7流式细胞仪分选的细胞（血液肿瘤）。 如果必须采用显微切割分离细胞，具体需要多少 细胞还不确定，需进一步明确。8. 虽然需要提取多种大分子，但首先考虑 提取高质量的DNA同样能够提取高质量的RNA样本处理全血标本血清的分离是临床样本收集中的一项重要 内容，所得血清可用来直接检测样本中肿瘤抗原 和（或）抗体；分析血清中某种标志物以及相关 蛋白表达，进行细胞因子以及DNA和蛋白质的定 性和定量分析。临床肿瘤标本库主要采集接受肿 瘤外科手术患者之全血标本，采

14、集分为术前、术 后两部分。（1） 术前血指临床诊断明确，患者未经 任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等，已接受 上述治疗的患者样本需详细注明。（2） 术后血指接受手术后2周，患者未 接受任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等。采集血清操作时要严格注意安全防护，避免 对人、环境造成污染，需认真注意以下事项：1）人员要求：操作时应戴手套以及眼睛和 粘膜的保护装置。只有经过严格培训的技术人员 才能进行这项工作。2）实验操作技术要求：规范的操作可以避 免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清 应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。3）移液管使用后应完全浸入适当的消毒液 总。移液管应在消毒液中浸泡适当的时

15、间， 然后 再丢弃或灭菌清洗后重复使用。4）带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后 应防止在适当的防漏容器内高压蒸汽灭菌和（或）焚烧。5）应备有适当的消毒剂来清洗喷溅和溢出标本。步骤(1) 取血液标本，每例米集10mL (不少于5mL , ACD(构橼酸盐葡萄糖抗凝剂)抗凝(或 肝素、EDTA首选ACD其次EDTA，用于细胞 培养的血液标本，室温保存；准备DNA提取的血 液标本，4°C保存。约10mL全血分装入红帽管(不 含抗凝剂)和紫帽管(含2%EDT抗凝剂)中。(2) 红帽管用于分离血清，室温放置30min 后离心。紫帽管用于分离血浆。(3) 尽快离心(30min内)。此时悬液分为

16、三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在红 细胞层上呈灰白色的白细胞层为外周血淋巴细 胞。(4) 轻轻吸取淡黄色血浆上层液放入 1.5mL 离心管中，每管100卩L,共9管，余液放入1 管中。做好标记，P代表血浆，S代表血清。(5) 编号后放入-80 C低温冰箱保存。组织组织样本可立即固定，备病例诊断用；或分 割后，采取不同方式进行保存。样本DNA RNA勺提取 按常规实验方法提取肿瘤组织和癌旁、正常组织的基因组DNA总RNA石蜡切片用于核酸 提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶 K 消化后即可进行DNA提取。新鲜组织块的处理步 骤首先用生理盐水洗两次，然后将其捣碎或切 碎，加入生理盐水后

17、剧烈震荡混匀，离心，弃上 清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。3 组织芯片制备组织芯片制作流程包括：阵列设计、入选样 本病理复诊与标记、取芯（供体蜡块）、点阵（受 体蜡块、切片制成组织芯片）：1）检测芯片：主要用于检测标志蛋白表达 状况和水平，可以使用具有明确临床病理学资料 但随访时间短或无患者生存期的组织标本制备。2）分型芯片：在用于检测标志蛋白表达状 况和水平的基础上，能够用于临床分子分型研究 和评价。所用的组织要求有系统的临床随访和生 存期资料，这是一个关键问题。样本保存1. 采集的生物样本分装、标记和保存是十分 重要的，有些样本要在几年或更长的时间以后才 会用于实验研究，因此质量监控和检索

18、的方便尤 为关键。要保证实验样本的质量和数量能够在若 干年后用于DNARNA和蛋白质提取和实验分析。2. 所有生物样本应分装贮存，尽量避免多 次反复解冻。长期保存样本的最适保存条件为在 液氮或-135 C保存。3. 生物样本的容器应采用螺口的冻存管， 能够在低温下长期储存，玻璃管或弹出式盖子的 管子不适合长期储存。标本储存分为组织标本保存和提取物保存 两大类。1. 组织标本保存（1）新鲜标本：可用来保存新鲜标本的实 验体系包括：细胞培养液、缓冲液如磷酸盐缓 冲液（PBS 、核酸保护剂（如 RNA laterTM ） 中，或直接做干燥处理，或于室温保存或置于冰 浴中。组织标本可在切割后的24h内

19、转送到研究 者的实验室中。新鲜组织最好是保存于 50聽醇 中，具体做法是，先用生理盐水将组织洗 1次,切成宽度1cm的小片，加入适量的生理盐水， 然后，边摇边加入无水乙醇至终浓度为 50%这 样固定的组织标本室温下可保存数日，4C可保存6年。（2）冻存标本：标本冻存管可直接冻存于 液氮，再转移到-70 C冰箱，或OCT包埋后储存 于液氮或-70 C。标本在运送过程中，可将其置 于冰中保存。（3）石蜡固定标本：采用石蜡包埋，蜡块 编号，分类存放。定期整理液氮保存样本，移入-80 C低温冰 箱内长期保存。2. 血清样本保存编号后分装、低温冻存，可置于-20 C、-70 °C 冰箱或液氮罐

20、中。有研究表明，用于 RNA测定， 最好是使用EDTA抗凝（严禁使用肝素，因其对 PCF扩增有抑制作用，且很难再核酸提取过程中 完全去除）全血标本，抗凝后 6h内分离血浆， 如使用血清标本，则需尽快（2h内）分离血清， 标本的短期（1-2周）保存可在-20 C下，较长 期保存应在-70 C下。3. 体液标本临床体液标本包括胸腔积液、腹水、脑脊液、 尿液等，可按水样标本的方式离心去沉淀后， 提 取核酸。临床体液标本长期(超过2周)保存应 在-70 C下。4. 提取物保存按常规实验方法提取肿瘤组织和癌旁、正常 组织的基因组DNA总RNA定量后分装提取的 核酸，保证每份标本可供五个研究者使用，具备

21、50-100次核酸研究用量，并保存使用记录。由于靶核酸(尤其是RNA易受核酸酶的作 用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测 定的有效性极为重要。检测靶核酸为DNA的标本，可在2-8 C下保存3d,也可于10mmol/L Tris ， 1mmol/L EDTA (pH7.5-8.0 )缓冲液中 4C下保 存。而检测靶核酸为RNA勺标本，一旦采集送到 实验室后，则应在-20 C以下冻存。为使临床标本中可能存在的核酸酶失活， 可 加入chaotropic 物质，最常用的是4mol/L异硫 氰 酸胍盐 (Guanidinium isothiocyanate ， GITC)，并同时与还原剂如3 -巯

22、基乙醇或二巯基 乙醇一起使用。使用终浓度为 5mol/L的GITC, 可使RNase不可逆的失活，如浓度4mol/L则失 去对RNase的抑制作用，而使RNA迅速降解。使 用GITC作为稳定剂保存靶核酸为 RNA的标本， 标本可在室温下稳定约 7d。此外，如测定的靶 核酸为血循环中的RNA为避免室温放置过久而 致RNA的降解，最好不要使用血清标本，而应使 用EDTA抗凝后尽快分离后的血浆标本。临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核 酸为DNA可室温保存数月至数年，如靶核酸为 RNA则可稳定数周。研究表明，保存在滤纸上 的标本，保存时间长，还可因为标本中的PCR抑 制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白

23、等吸附于滤纸 上,而不对后面的扩增检测造成影响。 标本加于 滤纸片上，对于标本的室温运送非常方便， 适用 于特定病原体的分子流行病学研究，并且不管是 全血、血清（浆），还是尿液、分辨、分泌物等 均可用此种方法。样本运输标本一经采集，则应尽可能快的送至检测实 验室。对于靶核酸为DNA的标本，如是在无菌条 件下米集，则可以在室温下运送，建议采集后， 在8h内送至实验室。靶核酸为 RNA的标本，采 集后建议在4h内送至实验室，短时间内的运送如10min左右，则可室温下运送，如为较长时间， 则应在加冰条件下运送。如标本中加入了适当的 稳定剂如GITC的血清(浆)标本，则可在室温 下运送或邮寄。所有临床

24、标本在采集后送至实验 室之前，均应暂放在2-8 C临时保存。运输容器应为密闭的一次性无菌装置标本的收集、标记、运输和发放(1) 标本在设施内的传递 为了避免意外 泄露或溢出，应当使用盒子等二级容器，并将其 固定在架子上使装有标本的容器保持直立。二级 容器可以是金属或塑料制品，应该可以耐高压蒸 汽灭菌或耐受化学消毒剂的作用。(2) 标本的接收与发放标本接收与发 放形式有如下三种：1) 新鲜组织标本：组织标本可在切割后用 细胞培养液及磷酸盐缓冲液(PBS和生理盐水 保存。在运送过程中，新鲜组织的组织标本和血 清标本置于冰浴中。同时可根据分子生物学实验 要求，利用RNA呆护剂防止RNA降解2）冷冻组织和血清标本：冷冻标本从-70 C 冰箱中取出后，立即置于液氮或干冰中，避免组 织和血清标本运输过程中融化。异地发放最好采 用航空方式。3）石蜡包埋的组织标本：核对编号后，观 察蜡块是否有变形、挤压、损坏，检查证明完好 后放入保存盒中。具体的临床PCR实验室，应根据待测靶核酸 的特性，对各种临床标本的运送条件作出相应的 规定。此外，标本的运送还应充分考虑生物安全 问题，应符合相应的生物安全要求。