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1、厄罗替尼对肺腺癌细胞凋亡的影响 作者：白小燕 牟晓燕 姜淑娟 王亚丽 刘庆亮【摘要】 目的 研究厄罗替尼对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的影响以及对表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达的影响。方法 采用MTT法检测不同浓度的厄罗替尼对A549细胞的增殖抑制作用;以倒置相差显微镜、流式细胞术、TUNEL法及DAPI荧光染色法检测细胞凋亡;以免疫荧光法分析厄罗替尼对EGFR蛋白表达的影响。结果 厄罗替尼抑制A549生长呈时间浓度依赖性;厄罗替尼处理A549后倒置相差显微镜、DAPI及TUNEL均见到明显的凋亡细胞(P<0.05);药物处理组使细胞发生明显的G1期阻滞(P<
2、;0.05);TUNEL检测到200 mol/L厄罗替尼组细胞凋亡率为(42.13±1.4)%，显著高于对照组(0.82±0.03)%(P<0.05);免疫荧光法表明厄罗替尼明显下调EGFR表达(P<0.05)。结论 厄罗替尼杀伤A549细胞的机制与介导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G0/G1期及阻滞EGFR信号途径有关。 【关键词】 厄罗替尼;EGFR;A549细胞;细胞凋亡【Abstract】 Objective To explore the effects of Erlotinib on apoptosis andexpression of EG
3、FR in human pulmonary adenocarcinoma cell line A549 cells. Methods MTT assay was used to determine A549 cells proliferation. Inverted microscope, flow cytometry, DAPI and TUNEL were used to detect apoptosis. The expression of EGFR was determined by immunofluorescence. Results Erlotinib inhibited the
4、 growth of A549 cells in a dosedependent and timedependent.The cells treated with Erlotinib showed a typical apoptotic morphology (P<0.05) and G1 phase arrestting(P<0.05). The apoptosis rate of 200 mol/L Erlotinib group (42.13±1.4)% was significantly higher than that of control gr
5、oup(0.82±0.03)% (P<0.05). Immunofluorescence assay showed that Erlotinib downregulated the expression of EGFR. Conclusions Erlotinib can kill A549 cells，owing to inducing apoptosis and G1 phase arresting and downregulating the expresion of EGFR.【Key words】 Erlotinib;EGFR;A549 cell;Cell a
6、poptosis 表皮生长因子受体(EGFR)在多数恶性肿瘤中常呈过度表达，而在正常细胞中很少表达，多项研究表明40%80%非小细胞肺癌(NSCLC)存在EGFR过表达1。EGFR过表达预示存活率低、预后差、转移可能性大，表明EGFR信号转导通路的活化是肿瘤发生的最基本机制2。因此，从理论上说，利用EGFR抑制剂来治疗EGFR表达阳性的肿瘤应该具有良好的应用前景。厄罗替尼是一种口服的EGFR酪氨酸激酶拮抗剂，通过阻断NSCLC细胞生存、增殖中的某些信号转导通路而发挥作用3。本实验通过观察厄罗替尼在体外对A549细胞增殖、凋亡及EGFR蛋白表达的影响，探讨其作用机制，为厄罗替尼用于临床NSCLC
7、的治疗提供实验依据。1 材料与方法1.1 细胞及主要试剂 人肺腺癌细胞株A549由山东大学附属省立医院中心实验室提供，胎牛血清(FCS)购自杭州四季清公司，RPMI1640 购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)、DAPI染液购自Sigma公司,厄罗替尼(Erlotinib，商品名特罗凯)由罗氏公司惠赠。EGFR兔抗人多克隆一抗购自奥博森公司，FITC标记羊抗兔IgG及DAB试剂盒购自北京中杉公司， Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒购自晶美公司。TUNEL试剂盒购自美国罗氏公司。Labsystems MutisKan Ascent全自动酶标测试仪购自芬兰Labs
8、ystems公司,EPICS XL4型流式细胞仪购自美国Beckmancoulter公司。IX51倒置式基础型显微镜Olmpus购自日本。1.2 细胞培养和分组 人肺癌A549细胞株培养于10% FCS、100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素的 PRMI1640培养基细胞贴壁80%时以0.25%胰酶消化、计数及传代，1 w传23次。实验用细胞为接种24 h后的对数生长期细胞。实验细胞分组：正常对照组(A组);低浓度组(厄罗替尼25 mol/L，B组);中浓度组(厄罗替尼100 mol/L，C组);高浓度组(厄罗替尼200 mol/L，D组)1.3 药物配制和使用 厄罗替尼用适量DMSO
9、溶解，储存在-20，药物活性无改变，每次实验前解冻，用新鲜培养液配成相应工作浓度。所有实验中的DMSO终浓度均小于0.1%，根据Augustine Rauch等的研究成果4,该浓度的DMSO对实验结果无显著影响 。1.4 四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测细胞增殖 0.25%的胰蛋白酶消化对数期生长的细胞，悬浮于含10%FCS的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为5×104细胞/ml，每孔100 l接种于96孔培养板，5 000细胞/孔，培养24 h后，去上清分别加入含有不同浓度厄罗替尼的RPMI1640培养液100 l，使厄罗替尼的终浓度为25、100、200 mol/L。同时设阴
10、性对照组、空白对照组，阴性对照组为只加RPMI1640培养液，空白对照组为不加细胞而只加培养基，每组设3个平行复孔，分别培养24、48、72、96 h后，每孔加入MTT 20 l(5 mg/ml)，混匀，37孵育4 h后，吸去上清液，加入150 l的DMSO，振荡培养板10 min，用酶标仪检测每孔490 nm波长吸光度值(OD)，实验重复3次求其平均值。据吸光度值计算细胞抑制率。抑制率(%)=(1-实验组平均值OD490/对照组平均值OD490)×100%，以药物浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制细胞生长抑制曲线。上述实验重复3次。1.5 细胞凋亡形态学观察 在倒置显微镜下观察培养
11、瓶中细胞的生长状况及形态学改变并拍照。1.6 流式细胞仪、DAPI荧光染色法及TUNEL染色法检测细胞凋亡1.6.1 流式细胞仪 细胞接种在小皿中，37孵育24 h后按以上分组方法加药， 48 h后常规胰酶消化制成1×106/ml的单细胞悬液，冷PBS洗2次，1 000 r/min离心5 min,弃去上清，加入结合缓冲液 100 l,依次加入钙依赖性磷脂结合蛋白(Annexin)和碘化丙啶(PI)，常温避光染色15 min，直接加结合缓冲液600 l，重悬后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.6.2 DAPI荧光染色 细胞凋亡观察取经药物处理和未处理细胞涂于载玻片上，滴加DAPI染料(1
12、 g/ ml，甲醇配制)，常温作用23 min，PBS冲洗3次，置荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。1.6.3 TUNEL凋亡染色 各组细胞爬片用PBS冲洗3次，用新鲜配置的40% 多聚甲醛(PBS溶液配制)室温固定30 min;PBS洗3次，5 min/次;3%H2O2中37孵育15 min以封闭内源性过氧化物酶;PBS洗3次，5 min/次;细胞的通透：加入0.2% TritonX100枸橼酸钠缓冲液中冰浴10 min;PBS洗3次，5 min/次;加20 l的TUNEL反应混合液，在湿盒中37反应60 min;PBS洗3次，5 min/次;信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加25 l 转化
13、剂POD反应液，在湿盒中37孵育30 min;PBS洗3次，5 min/次;加入25 l DAB底物溶液，室温孵育10 s;自来水冲洗10 min;复染核，脱水、透明、封片、镜检。同一处理随机选择至少10个观察视野，以凋亡阳性细胞数占细胞总数的百分比为细胞凋亡率(%)。1.7 流式细胞仪检测细胞周期 细胞以5×105/ml接种24 h，分组加药，48 h后收集细胞，冷PBS漂洗3次，按照细胞周期检测试剂盒说明书操作，最后上机检测，并用Multicycle for windows软件分析细胞周期分布的变化。1.8 免疫荧光检测EGFR蛋白的表达 将对数生长期的A549细胞接种于含细胞爬
14、片的24孔板内，常规培养，待细胞生长至单层时，24 h后分组加药，继续孵育48 h后，PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍，每次5 min。山羊血清封闭30 min，吸弃。分别EGFR一抗(150)4湿盒内过夜，FITC标记二抗(150)37避光孵育2 h，PBS洗3遍。95%甘油封片后照荧光片。以PBS代替一抗作为阴性对照。1.9 统计学分析 实验数据以x±s表示，用SPSS11.0软件进行t检验、2检验和方差分析。2 结 果2.1 药物对细胞增殖的抑制作用 使用不同浓度的厄罗替尼处理对数生长期的细胞24、48、72、96 h后，MTT比色法显示
15、，对照组细胞生长率明显高于各实验组，实验组之间有明显差异。表明厄罗替尼对人肺癌A549细胞生长有抑制作用，且这种抑制作用呈浓度和时间依赖性。见图1。图1 MTT检测厄罗替尼对细胞生长的抑制作用2.2 细胞形态学观察 加药前对照组与实验组A549细胞数量和形态基本一致。48 h后，正常对照组细胞紧密贴壁，边界清楚、透明度高，生长旺盛，可见各期核分裂相;实验组细胞体积缩小，胞内出现颗粒，形态改变，细胞间隙增大，变圆脱落，随药物浓度升高颗粒增多细胞开始碎解，见细胞碎片和凋亡小体。见图2。2.3 细胞凋亡分析2.3.1 流式细胞仪Annexin VPI双标法 厄罗替尼作用于A549细胞48 h后，流式
16、细胞仪检测到细胞凋亡，且细胞凋亡率随着药物浓度增高而增高，A、B、C、D组细胞凋亡率分别为(1.67±0.11)%、(8.42±0.56)%、(28.23±1.33)%、(45.54±2.24)%，见图3。2.3.2 DAPI荧光染色细胞凋亡观察 染色后荧光显微镜下见对照组核形态均一无边聚，胞内染色均匀一致，形状规则。而药物处理组见核凝聚浓缩，染色较深、染色质浓集、荧光增强、碎裂呈大小不等的碎片，形成凋亡小体。随厄罗替尼浓度增加，核浓缩程度加大，颗粒细胞增多，凋亡程度增加。见图4。2.3.3 TUNEL染色检查结果 TUNEL染色阳性细胞表现为细胞胞核呈
17、棕黄色着色，细胞质不着色。在100倍显微镜下计数阳性细胞的个数，计算细胞凋亡率。实验中各组均可见凋亡阳性细胞。与A组(0.82±0.03)%相比，B组细胞凋亡率(7.41±2.1)%明显增高(P<0.05)。D组细胞凋亡率(42.13±1.4)%不仅明显高于B组(P<0.05)，而且亦明显高于A组(P<0.05)，提示厄罗替尼能增加A549细胞的凋亡。见图5。2.4 药物对细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，厄罗替尼作用48 h，G0期细胞比例明显增加;S期细胞比例减少。B组G0期细胞百分率为(43.3±1.
18、5)%，明显高于A组(28.1±2.2)%(P <0.05)，而D组G0期细胞百分率为(70.6±1.6)%与B组比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明经过厄罗替尼作用后肿瘤细胞被阻滞于G0期，使进入S期的细胞明显减少。见表1。2.5 免疫荧光法检测 EGFR主要定位于A549细胞的细胞膜与细胞质，呈强阳性表达，经不同浓度的厄罗替尼处理后，EGFR表达明显降低，阴性对照为阴性。见图6。表1 流式细胞仪检测各组细胞周期分布的变化3 讨 论在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首5。虽然由于外科手术的进步和早期诊断水平的提高，NSCLC的切除率有
19、所提高，但根治性切除、肺叶切除等方法仅适用于少数病人，对于进展期NSCLC，化疗仍是目前常用的治疗方法。然而，一线的化疗有效率不足约30%6，靶向EGFR的治疗是肺癌治疗领域中的新靶点。EGFR与其配体结合，引起受体自动磷酸化而活化，活化的受体成为信号转导复合物，并活化RAS/MAPK，PI3K/AKT和STATs信号转导通路7。这些信号转导通路与肿瘤的生长和进展过程，包括细胞增殖、凋亡的抑制、转移和新血管生成等密切相关8。厄罗替尼是一种小分子的酪氨酸激酶抑制剂，通过在细胞内与三磷酸腺苷竞争结合受体酪氨酸激酶的胞内区催化部分， 抑制磷酸化反应， 从而阻滞向下游增殖信号传导，抑制肿瘤细胞配体依赖
20、或配体外依赖的HER1/EGFR的活性，达到抑制癌细胞增殖作用。研究发现厄罗替尼可以抑制许多部位癌细胞的生长，包括肺癌、头颈部恶性肿瘤9、胰腺癌10。本实验中MTT法显示细胞的相对增殖抑制率随着药物浓度提高及作用时间的延长而增高，说明厄罗替尼对A549细胞有体外增殖抑制作用且这种抑制作用，有时间和浓度依赖性。厄罗替尼通过调节凋亡相关基因诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。细胞凋亡时，细胞缩小，核固缩、边集、浓缩，凋亡小体出现。本研究表明厄罗替尼可诱导A549细胞凋亡;TUNEL染色结果显示实验组的厄罗替尼引起的细胞凋亡率明显高于阴性对照组，且低浓度组与高浓度组之间存在显著性差异。流式细胞仪分析进
21、一步证明厄罗替尼是通过诱导A549细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。细胞周期中存在G1/S期和G2/M期两个重要的调控点，G1起点正调控点累积到一定程度，周期越过G1/S交界点，细胞不再依赖于细胞外促细胞生长因子而顺序完成整个细胞周期，因而G1/S调控点是影响细胞周期的关键，有研究证明11，厄罗替尼在体外可使肺癌细胞株阻滞于细胞周期G0/G1期。本实验中，厄洛替尼引起G0/G1期阻滞，并随药物浓度增加G1期细胞明显增加，S期细胞比例明显下降，提示细胞周期阻滞也是该药抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡的机制。厄罗替尼与EGFR结合后，阻断其活性，下调EGFR的表达，干扰EGFR介导的信号转导通路，打破凋亡促进因子
22、与凋亡抑制因子基因的平衡表达，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。本实验免疫荧光结果显示正常A549细胞EGFR蛋白过度表达，表明过度表达的EGFR在肺腺癌演化过程中可能起着重要作用;在厄罗替尼处理组，不同浓度梯度的厄罗替尼均能下调EGFR的表达，高浓度处理较低浓度处理更为明显的下调EGFR蛋白表达(P<0.05)，说明厄罗替尼抑制肺腺癌细胞生长可能是通过抑制EGFR信号传导通路实现的。总之，厄罗替尼抗肺腺癌的作用机制可能是通过诱导细胞凋亡、干预细胞周期及阻滞EGFR信号传导通路有关。为厄罗替尼应用于肺腺癌的临床治疗提供了实验依据。【参考文献】 1 Selvaggi G，Novello
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