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1、柴胡皂甙d对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期的影响 作者：张国平，祝葆华，王兰天，童传明，敬敏【摘要】 目的 探讨柴胡皂甙d（SSd）对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。方法 (1)常规培养人肝癌HepG2细胞；(2)噻唑蓝（MTT）实验观察不同质量浓度SSd处理HepG2细胞72 h后以及10mg/L的SSd作用HepG2细胞不同时间对HepG2细胞生长指数的影响；(3)流式细胞术（FCM）检测SSd处理HepG2细胞48h后细胞周期的分布。结果 SSd能明显抑制HepG2细胞的增殖，以10mg/L的SSd作用48h的抑制作用最明显。FCM检测显示SSd作用48h后实验组处于S期的
2、细胞数较对照组明显减少（P<0.01）。结论 SSd对人肝癌HepG2细胞的体外增殖具有抑制作用,并能使细胞周期中处于S期的细胞数减少。 【关键词】 柴胡皂甙d; HepG2; 增殖； 细胞周期 Abstract: Objective To study the effects of saikosaponinsd (SSd) on proliferation and cell cycle in the human hepatocellular carcinoma cell line, HepG2 cell line. Methods HepG2 cells were culture
3、d and treated with SSd. The cell growth rate was measured by monotetrazdium（MTT） assay and the cell cycle was determined by the flow cytometry (FCM) analysis. Results The SSd obviously inhibited the proliferation of HepG2 cell line in a concentration and time dependent manner, the maximum response o
4、f the cells to SSd was at the concentration of 10mg/L and the treatment timepoint of 48h. Compared with the control, the cells treated with 10mg/L SSd for 48h significantly reduce cell numbers in S phase (P<0.01). Conclusion The SSd could inhibit the proliferation of HepG2 cell line and arres
5、t its cell cycle in S phase. Key words: saikosaponinsd; HepG2; proliferation; cell cycle 肝癌是我国常见恶性肿瘤,是严重危害人民健康的重大疾病之一,其发病率呈逐年上升趋势。中医药在肝癌的综合防治中发挥着重要作用。从中医药中挖掘防治肝癌的单方、复方和有效成分已成为抗肿瘤研究的重要内容。柴胡是我国传统中药,具有明确的抗肿瘤作用。SSd是从柴胡中分离、提取的最主要的有效成分。近年研究表明：SSd具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞调亡、调节机体免疫功能等多种作用13,其抗肿瘤作用日益受到研究者的重视。目前对SSd在
6、肝癌防治中作用的研究较少。本实验通过观察SSd对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期的影响,以期探讨SSd对肝癌的作用。 1 材料与方法 1.1 材料 SSd购买自江西本草天工科技有限公司(HPLC>98 )；RPMI1640(Medium 1640,GIBICO,USA)；新生牛血清（杭州四季青生物材料工程公司）；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；96孔细胞培养板(Corning公司)；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（北京华美生物工程公司）；碘化丙啶（PI）染色液（南京凯基生物公司）；HepG2细胞由广东医学院天然药物研究与开发重点实验室长期冻存；超净工作台；CO2孵箱；倒置相差显微镜；
7、酶标仪(ELX800,USA)；流式细胞仪（EPICS XL Coulter, USA）。 1.2 方法1.2.1 HepG2细胞的培养HepG2细胞于含体积分数10%小牛血清,100U/mL青链霉素的RPMI1640中,放置于37、体积分数为5%、饱和湿度的CO2孵箱中培养,每两天传代一次。取对数生长期的细胞用于实验。1.2.2 SSd溶液的配制电子天平称取SSd粉末10mg加入200 L DMSO溶解,用无血清RPMI1640培养液定容为25mL得SSd溶液质量浓度为400mg/L。0.22m过滤除菌,用无血清RPMI1640培养液分别稀释为200、100、50、25mg/L4种质量浓度,
8、4保存备用。1.2.3 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测SSd对细胞增殖的影响制备细胞悬液并调整细胞浓度为4×104/mL,接种于96孔板,每孔100L（4000个细胞）。培养箱内培养过夜后随机分为4组。分别加入含SSd终质量浓度为20、10、5、2.5的培养液200L，并设加等体积RPMI1640培养液的阴性对照组,每组5个复孔。分别作用24、48、72h后每孔加入新鲜配制的0.5%MTT储存液20L/孔,继续培养4h,弃上清后每孔加入DMSO 150L,低速震荡10min以溶解细胞内结晶。酶标仪检测各孔570nm处吸光值,按如下公式计算抑制率。抑制率=(对照组A值实验组A值)/
9、对照组A值×100%。1.2.4 FCM检测SSd对细胞周期的影响取对数生长期的HepG2细胞传代,培养箱内培养过夜,将HepG2细胞的培养液换为含10mg/L的SSd溶液,继续培养48h。0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,制备细胞悬液,1000r/min离心8min,冷PBS洗两次,70%预冷乙醇固定,4保存过夜。上机前离心去除乙醇,冷PBS洗两次,加入50mg/L的PI染料1mL ,4闭关染色30min。400目尼龙网过滤后FCM检测细胞周期分布。 1.3 统计学处理 实验数据以(±s)表示,采用统计学软件SPSS 13 .0进行分析,计量资料多组间比较采用随机分组单因素
10、方差分析及q检验,两组间比较采用t检验；计数资料采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 SSd对细胞增殖的影响 经不同质量浓度SSd作用48h后,HepG2细胞的增殖即受到不同程度的抑制(P<0.05），当SSd的质量浓度从2.5mg/L增加到10mg/L时，其抑制率也明显增加（见表1）。10mg/L的SSd处理细胞24、48、72h后,其抑制率随着作用时间的延长也逐渐增强,以10mg/L的SSd作用48h抑制率最高,可达37.13%（10mg/LSSd抑制HepG2细胞生长的时间效应见图1）。但各时间点10mg/L组和20mg/L组之间的抑
11、制率差异无统计学意义(P>0.05）。表1 不同质量浓度SSd作用48h对HepG2抑制率的影响(略) 2.2 SSd对细胞周期的影响 经FCM分析表明：10mg/L 的SSd作用48h后,实验组处于S期的HepG2细胞数较对照组明显减少(P<0.01）,处于G1期的细胞较对照组明显增多(P<0.05）,G2期与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05）(见图2,表2)。表2 对照组和实验组细胞周期的分布(略) 3 讨论 柴胡是我国传统中药,其药用历史悠久,含有多种有效成分。越来越多的研究表明以柴胡为主的各种复方具有明确的抗肿瘤作用。柴胡
12、皂甙d是从中药柴胡中分离、提取的一种药理作用最强的一种三萜皂甙单体。近年来,有研究发现,SSd具有抑制肿瘤细胞增殖,抗实体肿瘤细胞间分子粘附,干扰肿瘤细胞S期DNA的合成及蛋白质代谢等作用4。有研究者发现柴胡皂甙对胃腺癌细胞具有显著的抑制作用5,亦有研究表明SSd对白血病细胞也有明显的抑制作用6。但SSd对肝癌细胞的作用及机制的研究尚少见报道。目前,在肝癌的发生发展过程中,被人们普遍接受的观点是：肝细胞增殖活性的升高和凋亡水平的下降共同发挥了重要的作用。Pizem等7认为在肝癌的发生发展过程中,细胞分裂失控,细胞增殖活性的升高是主要的,而与细胞凋亡的关系则相对较小。Paiva等8的研究也得出了
13、相似的结论。所以,抑制肝癌细胞增殖在抗肝癌研究中的作用似乎更为重要。本研究观察到：经SSd作用后,HepG2细胞的增殖即受到不同程度的抑制，SSd处理HepG2细胞48h的作用最明显。与对照组比较,2.5mg/L组的抑制率差异即有统计学意义（P<0.05）；当SSd质量浓度增加到10mg/L时,其抑制率也增加到37.13%，呈现出明显的质量浓度依赖性效应。除此以外,10mg/L的SSd处理HepG2细胞不同时间后,其抑制率的变化还具有明显的时间依赖性效应,以10mg/L的SSd作用48h的抑制率最高,可达37.13%。FCM检测发现:经SSd处理48h后,处于S期的细胞数较对照组
14、明显减少（P<0.01）,而处于G1期的细胞数较对照组增多（P<0.05）。据此推论: SSd处理HepG2细胞后,可能通过某种机制使细胞周期的G1/S检验点发生了阻滞,使细胞不能从G1期进入到S期,处于增殖状态的细胞相对减少,从而抑制了HepG2细胞的增殖。 本研究初步观察到SSd对HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用，可减少处于S期的细胞数,表明SSd具有一定的抗肝癌作用,其机制可能与SSd抑制肝癌细胞DNA合成有关，提示SSd在肝癌防治过程中具有潜在的临床应用前景。本研究为SSd在肝癌防治研究中的应用提供了初步的实验依据,但其确切的机制仍有待于进一步深入研究
15、。【参考文献】 1梁云,崔若兰柴胡皂甙d治疗抗肾小球基膜性肾炎的实验研究J第二军医大学学报,1999,20(7)：4164192Chou C C, Pan S L, Teng C M, et al. Pharmacological evaluation of several major ingredients of Chinese herbal medicines in human hepatoma Hep3B cells J.Eur J Pharm Sci,2003,19(5):403412.3Hsu Y L,Kuob P L,Lin C CThe proliferative inhibit
16、ion and apoptotic mechanism of saikosaponin D in human nonsmall cell lung cancer A549 cells JLife Sci,2004,75(10)：123112424 和水祥,罗金燕,赵刚,等.柴胡皂甙d对肝癌SMMC7721细胞环氧合酶2表达的影响J.中华肝脏病杂志,2006,14（9）:712714.5Fujioka T, Yoshida K, Fujii H, et al. Antiproliferative constituents from umbelliferae plants. VI,New ursa
17、netype saikosaponin analogs from the fruits of Bupleurum rotundifolium J. Chem Pharm Bull(Tokoyo),2003,51(4):365372.6步世忠,许金廉,孙继虎, 等. 柴胡皂甙d上调HL60细胞糖质Vb素受体mRNA并诱导细胞凋亡J.中华血液学杂志,1999,20（7）:354356.7Pizem J,Marolt V F,Luzar B, et al.Proliferative and apoptotic activity in hepatocellular carcinoma and surrounding nonneopastic liver tissueJ.Pflugers Arch,2001,442(6 Suppl1):R174176.8Paiva C,Oshima C T,Lanzoni V P,el a1.Apoptosis ,PCNA and p53 in hepatocellular carcinoma J.Hepatogastroenterology, 2002,49(46):10581061.9 / 9文档可自由编辑打印