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1、瑞舒伐他汀对乳鼠心脏成纤维细胞增殖和凋亡的影响 作者：王倩 崔炜 张海林 李亚【摘要】 目的 研究瑞舒伐他汀(Ros)对SD乳鼠心脏成纤维细胞（CFs）增殖的抑制作用，探讨其诱导CFs凋亡的作用机制。方法 采用新生SD大鼠CFs进行体外培养，单独给予10-5，10-6，10-7，10-8mol/L Ros或与10-5mol/L焦磷酸法尼酯（FPP）联合进行干预，应用MTT比色、BrdU比色、瑞氏吉姆萨染色倒置生物显微镜、Hochest 33258染色荧光显微镜、流式细胞分析技术等方法观察Ros对CFs增殖的抑制作用和其对CFs凋亡的诱导作用。结果 Ros不仅可明显抑制新生SD大鼠CFs增殖和D
2、NA合成，且可诱导CFs凋亡。10-5mol/L FPP可部分逆转此作用。结论 Ros为有效的抗心脏纤维化药物，不仅可明显抑制纤维化进程，还可逆转已出现的纤维化。 【关键词】 大鼠；成纤维细胞；细胞增殖；凋亡；瑞舒伐他汀；焦磷酸法尼酯他汀类药物因其安全可靠的降脂作用和心血管保护作用，在临床上广为应用。然而，目前他汀类药物的应用范围主要局限于高脂血症者及冠心病患者，对于心衰患者是否应用及其利弊一直存在着争议。本文主要观察新型降脂药瑞舒伐他汀（Ros）对SD乳鼠心脏成纤维细胞（CFs）的增殖抑制作用，和对CFs凋亡的诱导作用，为他汀类药物在心衰患者应用的可行性提供参考。1 材料与方法1.1 主要仪
3、器及试剂CO2培养箱（Heal Force）；生物安全柜（Heal Force）；倒置生物显微镜（Olympus 1×71）；相机（Canon DS126181）；倒置荧光显微镜（Nikon Ellipse TE2000S）；酶标仪（Fluostar）；离心机（Anke TDL802C）；恒温振荡器（富华SHZ82）；Ros（石药集团中奇制药技术有限公司，批号：20081201，规格：原料药）；焦磷酸法尼酯（FPP）（瑞士Enzo life sciences公司）；DMEMF12培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（奥地利PAA）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；噻唑蓝（MTT）（
4、美国Biosharp公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Amersco公司）；溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）试剂盒（德国Roche公司）；瑞氏吉姆萨染液（珠海贝索生物技术有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（Hochest 33258，美国Biosharp公司）。1.2 实验动物及CFs的培养和鉴定取23天龄的SD大鼠（河北医科大学实验动物中心提供,许可证号：1001007）。无菌开胸，剪取心室，用DHanks液清洗，剪碎。0.125%胰蛋白酶+0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液反复消化，分别收集各次消化细胞悬液，加入10%胎牛血清的DMEMF12培养基，离心，弃上清液。再加10%胎牛血清的DM
5、EMF12培养基，制成细胞悬液，置37、5% CO2培养箱内培养。根据CFs比心肌细胞贴壁速度快的特点，差速贴壁60 min，倾去上层未贴壁细胞，剩余的即为CFs，加入10%胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养。经倒置显微镜观察，免疫组化波形蛋白单克隆抗体阳性，鉴定为所需要的CFs，细胞纯度达98%。待CFs生长接近融合时以12传代，实验用24代细胞。1.3 实验分组实验共分9组，空白对照组；10-5mol/L Ros组；10-6mol/L Ros组；10-7mol/L Ros组；10-8mol/L Ros组；10-5mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组；10-6 mol/L
6、Ros+10-5 mol/L FPP组；10-7 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组；10-8 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组。1.4 MTT法测定细胞增殖取对数生长期CFs 5×107/L接种于96孔板中，37 、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h，每组设8个复孔。各组于药物刺激结束前4 h，每孔加入5 mg/ml MTT 10 l，37 继续培养4 h后终止培养，吸弃上清液，每孔加入150 l DMSO，振荡混匀，在酶标仪上选取490 nm波长测定吸光度值（A490值）。1.5 Brd
7、U法测定细胞DNA合成 取对数生长期CFs 5×107/L接种于96孔板中，37 、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h，每组设8个复孔。严格按照Brdu试剂盒说明进行操作。各组于药物刺激结束前8 h，每孔加入BrdU标记液 10 l，37 继续培养8 h后终止培养，吸弃上清液，每孔加入固定液200 l，室温孵育30 min，彻底去除固定液，每孔加入抗BrdUPOD工作液100 l，室温孵育90 min，弃去抗BrdUPOD工作液，每孔用200 l洗脱液洗涤3遍，弃去洗脱液，每孔加入显色液100 l，室温孵育15 min，每孔
8、加入1 mol/L H2SO4 25 l，摇床摇1 min，在酶联免疫检测仪上430 nm处测定吸光度值(A430值) 。1.6 凋亡检测1.6.1 瑞氏吉姆萨染色，倒置生物显微镜观察取对数生长期CFs 1×108/L接种于24孔板中，37、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h。吸弃各孔培养基，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗1遍，滴加瑞氏吉姆萨A溶液，使染液覆盖各孔细胞，染色1 min，将瑞氏吉姆萨B溶液滴加于A液上面，以洗耳球轻吹液面，使两液充分混合，染色10 min，吸弃各孔染液，无菌PBS洗3遍，倒置显微镜观察，拍照。1.
9、6.2 Hochest 33258染色，荧光显微镜观察将无菌的盖玻片置于24孔板内，以1×108/L细胞接种，37、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h。吸弃各孔培养基，无菌PBS洗3遍，甲醇冰醋酸(31)于4 固定 10 min，无菌PBS洗3遍，每孔加Hochest 33258染液（10 mg/L）500 l，避光染色30 min，荧光显微镜观察，拍照(激发波长340 nm，发射波长420 nm)。1.6.3 流式细胞仪检测断裂DNA取对数生长期CFs，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h。收集培养的细胞，悬浮于4预冷的
10、70%乙醇中。检测前用生理盐水洗涤细胞2次，调整细胞浓度为1×109/L ，取200 l细胞悬液，加100 l核糖核酸酶(RNase) 37 中孵育15 min，加200 l碘化丙啶，室温下避光5 min，300目尼龙网过滤后，流式细胞仪检测亚二倍体率。1.7 统计学分析采用SPSS13.0软件，计量数据用x±s表示。随机单因素方差分析LSD法进行组间的两两比较。2 结 果2.1 CFs增殖测定对MTT测定结果进行单因素方差分析，10-510-7 mol/L的Ros与空白对照组相比，差异显著，即10-510-7 mol/L的Ros可抑制新生大鼠CFs增殖。10-8 mol/
11、L的Ros与空白对照组相比差异不显著，即此浓度不能抑制新生大鼠CFs增殖。10-5 mol/L FPP可明显减轻各浓度Ros对CFs的抑制作用。见表1。2.2 CFs DNA合成测定对BrdU测定结果进行随机单因素方差分析，10-510-7 mol/L的Ros与空白对照组相比差异显著，即10-510-7 mol/L的Ros可抑制新生大鼠CFs DNA合成。 10-8 mol/L的Ros与空白对照组相比，差异不显著，即此浓度不能抑制新生大鼠CFs DNA合成。10-5 mol/L FPP可明显降低各浓度Ros对CFs DNA合成的抑制作用。见表1。表1 Ros对CFs增殖和DNA合成的影响(略)
12、2.3 瑞氏吉姆萨染色，倒置生物显微镜观察细胞10-5 mol/L Ros处理组的CFs，死亡细胞数目较对照组明显增加。10-5mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组死亡细胞数目明显减少，但仍多于对照组，即10-5mol/L FPP可部分逆转10-5mol/L Ros作用。见图1。2.4 Hochest 33258染色观察细胞凋亡形态学变化正常CFs Hochest 33258染色胞核形状规则；10-5 mol/L Ros组CFs Hochest 33258染色可见细胞凋亡的形态学改变：核固缩、核碎裂，出现大小不一碎片及凋亡小体；10-5mol/L Ros +10-5mol/L F
13、PP组CFs Hochest 33258染色，异常胞核明显少于10-5 mol/L Ros组。见图2。2.5 流式细胞仪检测结果10-510-7 mol/L Ros组细胞有亚二倍体峰出现，随药物浓度增加，CFs凋亡率增加。10-5 mol/L FPP可明显抑制CFs凋亡，降低CFs凋亡率。见表2。表2 Ros对CFs凋亡的影响(略)3 讨论 他汀类药物除了降脂外，尚有改善血管内皮功能，抑制血管平滑肌增殖，抑制心脏纤维化，抗炎，抗栓，抑制血小板聚集，降压，抗心律失常，调节免疫，抑制肿瘤等与降脂无关的作用。其共同的机制在于他汀类药物可通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA）向 L甲羟戊酸的转变，
14、进而抑制重要的类异戊二烯FPP和牛儿基牛儿基焦磷酸（GGPP）的合成。这两种焦磷酸酯是许多蛋白翻译后修饰的重要脂质载体。异戊二烯化多发生在C末端包含CaaX基序的蛋白（C为半胱氨酸，a为一脂肪族氨基酸，X为任意氨基酸），Ras 和 Rho GTP 酶家族成员就属此类蛋白。异戊二烯化的小G蛋白可以锚定于细胞膜上调节细胞骨架伸缩和胞内信号转导。 由于他汀类药物可通过抑制小G蛋白抑制细胞增殖的信号转导通路，国内外许多学者将他汀类药与抗肿瘤药联用，减少化疗药物抵抗，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，改善肿瘤患者的生活质量。Aberg等1的研究表明辛伐他汀可以通过抑制核转录因子(NFB)通路，诱导乳腺
15、癌细胞凋亡。Sutter等2的研究也表明他汀可以使肝癌细胞发生细胞周期阻滞和凋亡。Ahn等3研究发现，他汀类药物可以通过抑制肿瘤坏死因子（TNF）诱导的NFB表达，降低髓细胞性白血病细胞对化疗药物的抵抗，并增加白血病细胞的凋亡。结果提示，他汀类药物可能具有某些化疗药物的特性，即抑制可增殖细胞存活，并诱导其凋亡。 无论何种原因导致的心衰进程中，均伴有心脏CFs增殖和心肌重构，抑制心脏内的CFs增殖对于改善心功能有益。许多国内外研究均证实，他汀类药物可以抑制心脏纤维化，改善心脏舒张功能，延缓心衰进程，且无不良反应47。 本文体外实验结果表明，Ros不但可以抑制CFs增殖，而且可以诱导CFs凋亡，借
16、此推断他汀类药物不仅可以抑制心脏纤维化进展，还可能逆转已经发生的纤维化，这对于心衰患者，尤其早期心衰患者是有益的。【参考文献】 1 Aberg M，Wickstrom M，Siegbahn A.Simvastatin induces apoptosis in human breast cancer cells in a NF kappaBdependent manner and abolishes the antiapoptotic signaling of TF/FVIIa and TF/FVIIa/FXaJ.Thromb Res，2008；122（2）:191202.2 Sutter AP
17、，Maaser K，Hopfner M,et al.Cell cycle arrest and apoptosis induction in hepatocellular carcinoma cells by HMGCoA reductase inhibitors.Synergistic antiproliferative action with ligands of the peripheral benzodiazepine receptorJ.J Hepatol，2005；43（3）:80816.3 Ahn KS，Sethi G，Aggarwal BB.Reversal of chemor
18、esistance and enhancement of apoptosis by statins through downregulation of the NFkappaB pathwayJ.Biochem Pharmacol，2008；75（4）:90713.4 Chang SA，Kim YJ，Lee HW,et al.Effect of rosuvastatin on cardiac remodeling，function，and progression to heart failure in hypertensive heart with established left ventr
19、icular hypertrophyJ.Hypertension，2009；54（3）:5917.5 Loch D，Chan V，Hoey A,et al.Rosuvastatin attenuates heart failure and cardiac remodelling in the ageing spontaneously hypertensive ratJ. Basic Clin Pharmacol Toxicol，2009；105(4)：26270.6 Zaca V，Rastogi S，Imai M,et al.Chronic monotherapy with rosuvastatin prevents progressive left ventricular dysfunction and remodeling in dogs with heart failureJ.J Am Coll Cardiol，2007；50（6）:5517.7 Kjekshus J，Apetrei E，Barrios V,et al.Rosuvastatin in older patients with systolic heart failureJ.N Engl J Med，2007；357（22）:224861.11 / 11文档可自由编辑打印