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1、膀胱癌和肾癌中RASSF1A和BLU的甲基化状态【摘要】 目的 探讨RASSF1A和BLU在膀胱癌和肾癌中启动子甲基化状态及其意义。方法 采用甲基化特异性PCR (MSP) 技术分别在45例膀胱癌组织和相应癌周正常组织、12例肾癌组织及其相应癌周正常组织和3例非肿瘤患者正常膀胱组织中检测RASSF1A和BLU启动子区域的甲基化状态。结果 膀胱癌组织中，RASSF1A和BLU甲基化率分别为55.6% 和31.5%; 肾癌组织中, 两基因甲基化率为66.7% 和33.3%。RASSF1A和BLU启动子甲基化状态与膀胱癌临床病理参数无明显相关性(P>0.05)。在膀胱癌或肾癌中，RAS
2、SF1A和BLU启动子甲基化状态之间均无明显相关性(P>0.05)。 结论 膀胱癌和肾癌中,RASSF1A和BLU频繁发生高甲基化，高甲基化可能参与膀胱癌和肾癌两类肿瘤的发生。 【关键词】 膀胱癌 肾癌 RASSF1A BLU 高甲基化【Abstract】 Objectives To investigate the promoter methylation status of RASSF1A and BLU in bladder carcinoma and renal carcinoma and their significance. Methods The methylatio
3、n status of promoter of RASSF1A and BLU were examined by MSP in 54 cases of bladder carcinoma tissues and adjacent normal tissues from 45 cases, 12 cases of renal carcinoma tissues and adjacent normal tissues and 3 cases of normal bladder tissues from noncancerous patients. Results Hypermethylation
4、of RASSF1A and BLU was detected in 55.6% and 31.5% of bladder carcinoma tissues, retrospectively. In renal carcinoma tissues, hypermethylation of RASSF1A and BLU was detected in 66.7% and 33.3%, respectively. No association between the methylation status of RASSF1A and BLU with the clinical patholog
5、ical parameters of bladder carcinoma was found (P>0.05), neither was it found between the methylation status of RASSF1A and BLU in bladder carcinoma or renal carcinoma (P>0.05). Conclusions RASSF1A and BLU are found with frequent hypermethylation in bladder carcinoma and renal carcinom
6、a，which may be involved in tumorigenesis.【Key Words】 Bladder carcinoma Renal carcinoma RASSF1A BLU Hypermethylation 2000年，Lerman等在3p21.3区域内120kb长的肺癌最小纯合缺失区鉴定了8个基因，其中包括RASSF1和BLU。研究发现，RASSF1常见转录本RASSF1A和BLU在包括肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等常见肿瘤细胞系和癌组织中转录表达异常下调，启动子高甲基化，且点突变率极低，推测它们可能是新的肺癌候选TSGs。本研究，通过检测候选抑癌基因RASSF1A和BLU在
7、膀胱癌和肾癌中启动子甲基化状态，探讨RASSFIA和BLU两基因与膀胱癌和肾癌发生发展的关系。1 材料与方法1.1 研究对象收集2004年3月至2005年5月45例膀胱移行细胞癌患者膀胱切除标本的癌组织及相应的癌周正常组织(男36例,女9例,年龄3083岁，平均62岁)，3例手术切除的非肿瘤患者正常膀胱组织，12例手术切除的肾透明细胞癌患者癌组织及相应的癌周正常组织(男9例,女3例,年龄3975岁,平均56岁)。所有标本由同济大学附属第十人民医院(第一作者读研究性时实习医院)和上海市第一人民医院分院泌尿外科提供。膀胱切除术切除的膀胱癌组织标本病理分级按WHO方法：级27例，级11例，级7例 ；
8、临床分期按UICC标准：TaT1期31例，T2T3期14例。1.2 组织DNA的抽提 严格按照Wizard Genomic DNA Purfication Kit (Promega 公司) 试剂盒说明书抽提DNA，用紫外分光光度仪定量。1.3 DNA的亚硫酸氢盐修饰和MSP技术采用基因组DNA修饰试剂盒CpGenome DNA Modification Kit (Serelogical 公司)，取1g DNA按说明书操作步骤进行修饰。以修饰后DNA作为模板,分别利用甲基化和非甲基化特异性引物进行热启动PCR扩增(引物序列及扩增条件见表1)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。取10l扩增
9、产物进行琼脂糖凝胶电泳,GIS凝胶图像处理系统分析结果。表1 MSP 引物序列及扩增条件（略）注：MF代表甲基化特异性上游引物；MR代表甲基化特异性下游引物；UF代表未甲基化特异性上游引物；UR代表未甲基化特异性下游引物1.4 PCR产物克隆和测序随机挑选甲基化和未甲基化的4份PCR产物，TA克隆后进行测序，测序引物为M13通用引物，测序仪为ABI 377型测序仪。1.5 统计学分析采用SPSS 11.0统计软件包处理数据，进行2检验或四格表精确检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 甲基化状态检测 45例膀胱癌组织中，RASSF1A和BLU甲基化率分别为57.8
10、%(26/45)和28.9%(13/45)； 12例肾癌组织中，甲基化率分别为66.7%(8/12)和33.3%(4/12)；1例膀胱癌癌周正常组织发现RASSF1A启动子高甲基化，其余所有癌周正常组织和正常膀胱组织均未发现基因异常甲基化。两基因启动子高甲基化与膀胱癌患者临床病理特征的相关性见表2。膀胱癌或肾癌中，两基因甲基化之间均无明显相关性(P>0.05)，见图1。表2 膀胱癌组织RASSF1A和BLU基因甲基化与临床病理特征之间的关系（略）2.2 克隆测序结果 见图2。3 讨论 RASSF1A是RASSF1最常见的转录之一，cDNA全长1873bp，编码含340个氨基酸的蛋
11、白质，由于其核苷酸序列的羧基端与小鼠Ras效应蛋白Nore1高度同源而得名。在包括肺癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌等常见肿瘤中发现RASSF1A启动子高甲基化和转录失活，且高甲基化与转录失活密切相关，体内及体外实验己表明RASSF1A可抑制肿瘤细胞系的生长，从而将其确定为3p21.3区域主要的侯选TSG，6。 在膀胱癌中，有学者对RASSF1A基因展开了研究，并得出了相似的结果，但目前该基因异常改变与肿瘤临床病理参数相关性结论并不一致，。本研究结果表明，在膀胱癌中 RASSF1A基因启动子频繁发生高甲基化改变，提示该基因甲基化可能与肿瘤的发生相关；虽然甲基化与肿瘤临床病理参数无显著相关性, 但由于在
12、级和TaT1期肿瘤中基因甲基化率均较高，结合本资料1例癌周正常组织中也发现基因甲基化改变，提示RASSF1A基因甲基化可能参与了该肿瘤发生的早期阶段，有望成为膀胱癌早期诊断的有用指标。在部分癌组织中，琼脂糖电泳同时检测到甲基化和未甲基化条带，这一方面可能因为两条等位基因中存在未甲基化等位基因，另一方面可能因为肿瘤细胞中难免有正常细胞污染。 BLU基因位于RASSF1基因的上游，在蛋白分子的羧基端含有一个DNA结合功能域MYND锌指功能域，该功能域同样位于AML/ETO、BS69、suppression等蛋白内，这些蛋白分子分别在转录抑制、病毒癌蛋白结合，以及细胞周期调控等方面发挥作用，。研究证
13、实，MYND功能域对这些蛋白功能的发挥是必须的，MYND功能域的存在暗示BLU基因可能同样参与了重要的转录调节途径。 BLU基因最初被鉴定为一种候选肺癌TSG。随后的研究发现，BLU基因在肺癌、乳腺癌、肾癌和神经母细胞瘤等癌细胞系中启动子区域高甲基化和转录水平明显下调，给予表达下调的部分肺癌和鼻咽癌细胞系，甲基化抑制剂后，表达能部分或完全恢复，该基因的外生性表达能有效抑制神经母细胞瘤和非小细胞肺癌的克隆形成，由此推测BLU基因可能是多种肿瘤的侯选TSG。在膀胱癌中，有关BLU基因的相关研究尚未见有文献报道，该基因在膀胱癌发生发展过程中的作用仍不清楚。本研究发现BLU基因在膀胱癌中发生一定频率的
14、高甲基化改变，基因甲基化率与肿瘤临床病理参数无显著相关性，实验结果与RASSF1A相似，但是有随着组织分级和病理分期升高的趋势，故认为BLU基因启动子高甲基化可能参与了膀胱癌发生的早期阶段，但与肿瘤发展预后的关系仍不明确。 除了膀胱癌，此次研究在12例肾癌组织中同样发现RASSF1A和BLU一定频率的高甲基化改变，推测RASSF1A和BLU基因启动子高甲基化可能参与了肾癌的发生。但是本组肾癌组织标本较少，尚需扩大标本作进一步研究。 BLU和RASSF1A是位于同一染色体区域内的两相邻基因。Agathanggelou 等研究发现小细胞性肺癌和鼻咽癌组织中RASSF1A和BLU甲基化状态之间并无相
15、关性(P>0.05)，由此认为BLU启动子高甲基化可能是一类独立事件，并非染色体3p21.3区域甲基化的结果。本研究结果表明，膀胱癌和肾癌组织中BLU甲基化率均较RASSF1A低，但二者甲基化率之间的差异并无统计学意义(P>0.05)，支持上述结论，同时认为RASSF1A基因高甲基化可能也是一独立事件。 综上所述，本研究结果显示RASSF1A和BLU是膀胱癌和肾癌甲基化谱成员之一，可能参与了该两类肿瘤的发生，但是甲基化的具体机制，甲基化与肿瘤临床病理参数的相关性，甲基化与基因转录失活的关系等若干问题，仍有待更深入的研究。【参考文献】 1 Lerman MI, Min
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