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1、质粒提取操作步骤 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒 产品编号：SK8191/SK8192 包装规格：50次/100次 试剂盒组成 组分 SK8191，50次 SK8192，100次 纯化套件（吸附柱+收集管） 50套 100套 Buffer P1 Buffer P2 Buffer P3 Buffer DW1 Wash Solution Elution Buffer RNase A 14 ml 14 ml 20 ml 25 ml 12 ml 5 ml 2.1 mg 28 ml 28 ml 40 ml 50 ml 24 ml 10 ml 4.2 mg VisualLyse 60 l 12
2、0 l 操作手册 保存方法及留意事项 试剂盒于常温运输，未开启的试剂盒可以于室温（1525C）保存，有效期见包装。加入RNase A后，Buffer P1请存放于28C，有效期为半年。其他组分可于室温存放一年，长期存放请置于28C。 Buffer P3和Buffer DW1中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上试验服，戴好乳胶手套，避开沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立刻用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的关心。 产品介绍 SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒是生工生物工程（上海）股份有限公司最新研制胜利的一种质粒小量抽提试剂盒。本产品采纳了一种新型的吸附材料，新吸附
3、柱拥有良好的流速、超强的DNA结合力量和优秀的洗脱效率。改良的配方使试剂盒的菌液裂解力量、DNA与吸附柱的结合力量大大加强，新型裂解染料VisualLyse的加入让裂解过程变得可视、可控，实现质粒得率最大化。对于高拷贝质粒，从6 ml过夜菌液（OD600 = 2.0）中可以获得超过35 g的质粒DNA。操作过程快速、便利，无需用法酚/氯仿抽提，无需乙醇沉淀，整个抽提过程可以在20分钟内完成。由本试剂盒抽提得到的质粒纯度高，OD260/OD280比值一般为1.81.9之间，OD260/OD230比值大于2.0，可挺直用于转化、DNA测序、PCR、基于PCR的突变、体外转录、酶切等后续试验。 1份
4、 1份 快速操作流程（质粒提取） 1. 预备工作。 菌体收集 裂解 上柱 洗涤 洗脱 检查Buffer P1中是否已经加入RNase A。 检查Wash Solution中是否已经加入乙醇。 检查Buffer P2和P3是否消失沉淀。 2. 取1.5-5 ml过夜培育的菌液，8,000 g离心2分钟收集菌体，弃尽培育基。 3. 在沉淀中加入250 l Buffer P1，彻底悬浮菌体。 4. 加入250 l Buffer P2，立刻温柔颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4分钟。 5. 加入350 l Buffer P3，立刻温柔颠倒离心管5-10次混匀。 6. 12,000 g离心5-10
5、 分钟。将上清液移入吸附柱，8,000 g离心30秒，倒掉 收集管中液体。 7. （选做）加入500 l Buffer DW1，9,000 g离心30秒，倒掉收集管中液体。 8. 加入500 l Wash Solution，9,000 g离心30秒，倒掉收集管中液体。 9. 重复步骤8一次。 10. 空吸附柱于9,000 g离心1分钟。 11. 将吸附柱放入一个洁净的1.5 ml离心管中，在吸附膜.加入50-100 l Elution Buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。 试剂预备 1. 自备材料：小型高速离心机（最大离心力 12,000 g）、1.5 ml离心管、
6、无水乙醇等。 2. 试剂盒初次开启，取1 ml Buffer P1至标有RNase A的离心管中，吸打混匀后将其全部加入Buffer P1中，混匀后在瓶身 做好标记。储存于28C，有效期为6个月。 3. 按瓶身标签说明在Wash Solution中加入相应量的无水乙醇（乙醇终浓度为80%），混匀后在瓶身做好标记。于室温密 封保存。 4. 每次用法前请检查Buffer P2和Buffer P3是否消失沉淀，如有沉淀，请于37C溶解沉淀，待冷却至室温后用法。 标准抽提步骤 1. 在含合适抗生素的培育基中接种目标菌株，于37C摇床充分振荡培育1216 h。 菌液状态对质粒得率特别关键，请用不超过容器
7、容量1/4体积的培育基进行培育。 处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高，过度培育可能导致DNA降解。 对于高拷贝质粒，从5 ml过夜菌液中通常可以获得超过20 g质粒DNA，不推举用法更大的菌液量。 对于低拷贝质粒，假如用法更多的菌液，则同一个样品分多管收集，每管不超过5 ml，分别裂解，合并同一个样品的各管裂解液通过同一个吸附柱来获得更高的得率。 3. 在菌体沉淀中加入250 l Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。 Buffer P1首次用法时请检查是否已加入RNase A。 肯定要彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量。 假如用法VisualLyse，则在加入250 l P1后再
8、加入1 l VisualLyse，振荡混匀。 2. 对于高拷贝质粒，取1.5-5 ml菌液，于室温，8,000 g离心2 min收集菌体，倒尽或吸干培育基。 VisualLyse需在临用前加入，挺直加入到Buffer P1中消失浑浊为正常现象。 4. 加入250 l Buffer P2，立刻温柔颠倒离心管510次混匀，室温静置24 min。 裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过5分钟。 假如同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采纳全部加入一起混匀的方法，计时从第一管样品加入开头。 假如用法了VisualLyse，则溶液呈现匀称的蓝色表示混匀良好，假如消失白色团块，则提示
9、菌体可能过量，宜选用更少的菌液重新开头。 5. 加入350 l Buffer P3，立刻温柔颠倒离心管510次充分混匀。 假如同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采纳全部加入一起混匀的方法。 加入Buffer P3后，离心管中会立刻消失大量白色絮状沉淀，假如用法了VisualLyse，则溶液由蓝色重新变为无色，有蓝色残留提示混匀不彻底，连续混合至蓝色全部消逝。 假如起始菌液较多，混匀后室温静置2分钟以彻底去除RNA。 的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 吸附柱的最大有效容积为750 l，假如裂解液较多，可以重复该步骤直到至全部裂解液流过吸附柱。 同一个收集管中。 对于End A+宿主菌
10、，如BL21，HB101，JM系列等，此步不能省略。 对于End A-宿主菌，如DH5，TOP10等，此步可以省略，但进行该步骤将进一步降低蛋白残留量。 6. 于离心机最大转速（ 12,000 g）离心510 min，将上清全部当心移入吸附柱，9000 g离心30 sec。倒掉收集管中 7. （可选步骤）在吸附柱中加入500 l去蛋白液Buffer DW1，9,000 g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入 8. 向吸附柱中加入500 l Wash Solution，9,000 g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 Wash Solution首次用
11、法前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。 9. 重复步骤8一次。 10. 将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 g离心1 min。 此步绝不行省略，否则残余的乙醇会严峻影响得率和后续试验。 11. 在吸附膜.加入50100 l Elution Buffer，室温静置12 min，9,000 g离心1 min。将所得到的质粒DNA溶液置于 -20C保存或用于后续试验。 Elution Buffer为2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，可以用TE或水（pH 7.0）代替。 将Elution Buffer预热至60C可以进一步提高得率。 假如质粒 8 kb，加入Elution Buffe
12、r后，在3760C温浴2分钟可以显著提高得率。 用法小于40 l的洗脱液可以得到浓度更高的DNA，但得率显著降低。 1、 常见问题解答 1. 未提出质粒或质粒得率较低 a. 大肠杆菌老化。请涂布平板培育后，重新选择单菌落进行液体培育。 b. 质粒拷贝数低。由于用法低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可以用法更多的菌量但需要相应增加溶液用法量。 c. 菌体中无质粒。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素用法浓度是否正确。 d. 碱裂解不充分。用法过多菌体培
13、育液，会导致菌体裂解不充分，可削减菌体用量或增加Buffer P1，P2和P3的用量。 e. 溶液用法不当。Buffer P2和P3在温度较低时可能消失浑浊，应置于37C温浴直至溶解，待冷却至室温后用法。 f. 吸附柱过载。不同产品中吸附柱吸附力量不同，假如需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培育基（如SOC或SOB）或宿主菌生长率较高，则须削减菌液用量。 g. 质粒洗脱不完全。质粒洗脱时，可适当加温（3760C）或延长溶解时间，对大质粒效果更为明显。 h. 乙醇残留。漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 i. j. k. l. 洗脱液加入位置不正确。洗脱液应加在硅胶
14、膜中心部位以确保洗脱液会完全掩盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 洗脱液不合适。洗脱效率与洗脱液的pH值有关，假如用法水进行洗脱，请确保其pH 7.0，假如pH过低可能导致洗脱量低，可以用1 N氢氧化钠溶液调整水的pH值。 洗脱体积太小。洗脱体积对回收率有肯定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但质粒浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。 洗脱时间过短。洗脱时间对回收率也会有肯定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。假如是低拷贝质粒或质粒大于8 kb时，可以分两次洗脱，并且对于大的质粒延长放置时间，让DNA完全溶解后再洗脱，可以提高洗脱效率。 m. 溶液失效。Buffer P2长期暴
15、露在空气中简单失效，请每次用法完后，立刻盖紧瓶塞，以免失效，造成碱裂解不充分。 2. 质粒纯度不高 a. 混有蛋白。不要用法过多菌体。经Buffer P1，P2和P3处理，离心后溶液应为澄清的，假如还混有微小蛋白悬浮物可 再次离心，并延长离心时间，完全沉淀蛋白后再取上清到吸附柱中。 b. 混有RNA。RNase A处理不彻底，请削减菌体用量或加入Buffer P3后室温再延长放置时间510分钟。假如Buffer P1 已保存6个月以上，请在Buffer P1中再添加终浓度为20 g/ml的RNase A。 c. 混有基因组DNA。加入Buffer P2后应温柔混匀，假如猛烈振荡，可能把基因组D
16、NA打断从而混杂在质粒中。假如加入Buffer P2后过于粘稠，无法温柔混匀，请削减菌体用量。细菌培育时间过长会导致细胞内DNA的降解，培育时间不要超过16小时。 d. 含大量核酸酶的宿主菌。BL21和HB101等End A+宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取和保存过程中可能导致质粒DNA 降解，影响提取质粒DNA的完整性，对于这些宿主菌请在操作过程中用法去蛋白液DW1。 e. 质粒的二聚体和多聚体形式。质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单 一条带。 3. 如何选择最合适的洗脱体积 SanPrep质粒试剂盒具有优秀的洗脱效率，通常状况下，用法50 l洗脱液进行洗脱，回收率能达到85%，用法小于40 l进行洗脱时，质粒浓度提高，但总得率下降明显，而是用超过100 l洗脱液进行洗脱，质粒得率增加不多，但浓度明显下降。如图所示，用户可以依据自己后续试验的需要进行选择。通常来说，假如预期质粒产量较低，则用法更少的洗脱液以保证得到的质粒浓度不至于过低，假如预期质粒产量较高，则可以用法更多的洗脱液进行洗脱。