《运用图像处理软件将同视野两种单标记免疫荧光图像合成为双标记.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《运用图像处理软件将同视野两种单标记免疫荧光图像合成为双标记.doc（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、Jul. 200521(4) 432 -434神经解剖学杂志(Chinese Journal of Neuroanatomy)运用图像处理软件将同视野两种单标记免疫荧光图像合成为双标记图像的方法研究国家门然科学从金(" 30371466) 国家973计划(2003CB515031 )和陕西省口然科学基金(2(X2450)资助项口 通 iN作 / 电话:029-83376755 E-nmil： u>u>iuri<$>! rininu. nlu. m焦西英程希平郎兵张萍王百忍掏躬游思维(第四军氏人学 神力科学研究所西安710032 )摘 要 探讨tn in机图俾处
2、丹技术将杵通荧尢显徴诡采集的同俛野单杯记临疫熒光图像合成为以标记图俾的方法 应用 Adolw lhmhnp7.0 fil hnag. J两卜图像处理软件将柠迪荧尢显做诡釆集的同出野单标记荧光图像柱加处理成収标记荧光图 像同激尢担描共聚條M.徵陵伏M的同双标记免怕炎光图俾进行比较 普通啖光显做镜采集的单标记荧比图像在分辨率及 涪晰度卜逊于激尢打描共聚您显微链采集的单标记1?1俾但显示的许储宅付般细胞形态史为完整细胞宾赴较氏R更连续 因 此在没右澈尢扫描共聚値舱箴饥时I用AT PI秋如7.0或Image J图俾处理软件将将通荧光显徴镜采集的同视野两种車 标记免疫荧比图像介成为保持朋仃待点角便I历清
3、晰的収标记荧光图像关键词収标记免疫啖光 免疫荧兀图像 .1小1忖1心叩7.0 Image JMETHODOLOGICAL STUDY OF SYNTHESIZING DOUBLE-STAINEDIMMUNOFLUORESCENCE IMAGE FROM TWO SINGLE-STAINEDIMAGES BY USING IMAGE-PROCESSING SOFTWARESJiao Xiying t Cheng Xiping, Img Hing. Zhang Ping tW(m Bairen, Ju Gong. Yun Siu ei(liKlituIr of XruniMMrix'rx.
4、 The Fiiunh Mililun Metlical I iiiveusii、. Wan 710032)Abstract lh prrrnl slu<l iiioiigait*d lh»* nirlh<xl«)h>g of s)nilirsizing Ivo singl*Mdiniiig immuii<>lluoi?M'rn«v images inlo <hm* vver-IsppiJ dinibk-slaiiil iiiuge In n>ing r«Hiipulrrizr<l inwgr哄 l
5、r<*liniques. U ilh ilnln- Hi<M«)shop 7.0 dinl Imdgr J imagr-pixx-essingMiflHaos. w” Miniek-Maiiil inMiniiHiiliiurvx-riH'e in>ugr> Likrn uiili a rixiinion lluoie*N« rn< r ini«'n>M'<)M in ihr sanir spinal n>ixl 3rra ucrew、“lhri7r、l inh> unr urrlapf
6、w*4image anti wh a HiUhr»ize«! imagt* 駅vinnparrd zilh the xmw dmible-luinefl inidgr pro«-rx?u-<| ziih 土 Ihmu st'aimiiignii«*r<»sc'<>pe. Thr inglr-MaiiirJ nuoivM*rn( <« iiimp*、ollrrtfsl uilli a c*oniiihN)fhmrrsr<*iiL niirr«hM*oprjhdSLj anha
7、pr inlt*grity .4 ihr >pinal e|>rn4>indl < dl> jikI longer uiiiiilrmiplr.l. allhough die <Mpa«'ih dihl ckHning |k)uer>«“I* Ihr iciKip*、a nr imH prnluminaiit a% Hhim* of ihr sumr iinugrs pnh-t*>MrJ uith ihr 八川 hxal mimztip、 Thus in llir al)MMkr “I* a c<)nfiH3I
8、mic'nist opr 4'(>(1*1(I <l<»ul)lr-*tain<»tl iiiiniuiK>nu<Hvscriir«* nnugrs «*an Iw U»laiti<l fn>m singk-Mnind images «Millr<(rtl wtlh a comnn>nOui>ivs<*rih'r mkvnnM*o>r liMiig A«h4>r P|iol«>shop 7.0 or l
9、inage J inidgr-pnh-rsing IrcdiiHqiit.Key words <l<)uble-si3inr<l iniiiiuih»nuoirM'rn< <. inii!iiin<»nu<irrs<nh*r imagr wI.Hobliop 7.0t linage J在观察免俊荧光多取染色标本和图像数据采集其它荧光的加色、混色和多标记部位不易区别等干时为凝免强荧光遮盖弱荧光、背底或视野过亮而致 扰1，在普通荧光显微镜多选用不同波长的滤光镜433焦西英等：运用图像处理软件将同视野两冲E标记免疫荧光图像合
10、成为収标记图像的方法研究组分别观察、采集同视野不同荧光素标记的荧光图 像',再将这些图像拼贴在一起根据明显的参照 物来判断相互的位證关系、；这种方法可取视野冇 限，图像欠美观，但因便宜、方便而被广泛应用。激 光扫描共聚焦显微镜具有普通荧光显微镜无法比拟 的优势除可采集髙品质的单标记图像其内设的计 算机图像处理软件，还可同时将不同波长滤光镜组 采集的单标记荧光图像自动合成为双标记和三标记 图像，但使用的昂贵限制了共聚焦显微镜的普 及"因此,我们尝试利用两种不同的图像处理软件， 将普通荧光显微镜采集的同视野单标记荧光图像栓 加处理成双标记荧光图像并同共聚焦显微镜获得 的同一视野的
11、单标记荧光图像及其自动生成的双标 记免疫荧光图像进行了比较：材料与方法1. 荧光标本的制作成年SD大鼠3只脊褴右侧胸12节段半切后 存活2 £常规灌注固定及损伤区冠状冰冻切片，行 兔抗Nestin ( 1 ： 400.上海生化所景乃和研究员惠 赠)和小鼠抗Vimentind： 1000, Sigma)免疫荧光 组织化学双重染色。在Olympus IX-70共聚焦显微 镜下对脊魅胸H节段中央管区域进行观察并采集 图像(Fig. 1 A,B)。再住Olympus BX-6O普通荧光显 微镜下通过转换滤色镜组对同一视野的两种荧光图 像进行观察和采集(Fig.2A,B)e2. 图像处理方法本
12、共聚焦显微境的操作系统为Huoview FV300 (Olympus公司)，貝双标记图像自动生成。即选择 所用荧光素(FITC. Texas Red)，按下focus键，调焦 至所需平面点击心p,选击scan,此时出现两个单 标记荧光图像窗口(Fig. 1A,B)和一个双标记荧光 图像窗口(Fig. 1C)3Adobe Photoshop 7. 0 软件(Adobe 公口J)的图像 处理:打开软件.选择菜单命令文件打开,拷贝打开 的Fig. 1B并粘贴到Fig. 1A上。选中窗口下拉菜单 中的图层，弹出图层面板，在其右上角将图层1B的 不透明度由100%降到50%，得到Fig. 1A和Fig.
13、 1B 的在加戏标图像，比时图像中荧光亮度只冇原图像 亮度的50%,将两图层合并后选择菜单命令图像 调整色阶，输入色阶项，将白色滑块山255拖至 125,确定后即可得到Fig. 1C'。同法可得Fig. 2A和 Fig. 2B叠加处理厉的双标图像Fig. 2C'。Image J软件的图像处理：打开软件选择菜单 命令FileOpen.打开 Fig. 1A 和 Fig. IB,选中 Process Image calculator 菜单弹出 Image calculator 对话框， 在 Image 1 处选 Fig. 1 A,Operation 处选 Add,Image 2 处选
14、 Fig. IB.选中 Create New Window,点击 OK 后 直接形成Fig. 1C'、°同法可得Fig. 2A与Fig. 2B叠 加后的双标图像Fig.2C：结 果共聚焦显徵镜采集的单标记荧光图像图形清 晰色彩逼真，分辨率高，因此其内设操作系统自动 合成的双标记图像保留了高质显单标记图像的优 点红、绿色荧光及两者叠加所形成的黄色色彩鲜 艳"曲于采集的单标记图像较薄脊騎室管膜细胞 像不完整，突起短而不连续(Fig. 1C中箭头所示)。 两种软件均可将单标记的荧光图像合成为在分辨率 及淸晰度上无任何差异的双标i己图像(Fig. 1C、C''
15、;)。曲BX40显微镜采集的单标记荧光图像(Fig. 2A,B)与Fig. 1A和Fig. IB相比，分辨率和清晰度 稍差，经两软件处理后分别得到的双标记图像(Fig. 2C',C'')仍保留了单标记图像的缺点，且红、绿色荧 光及二者叠加形成的黄色色彩不如Fig. 1A -C鲜 艳,但因切片较厚，所以细胞形态更为完整，突起较 长且更连续(Fig.2C',C'中箭头所示)。讨 论共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上加 装了激光扫描装置，利用激光点光源使被照射的样 品)1扩散最小，提升了图像的分辨率。另外,其检测 器前有一小孔，使得罪焦平面区域射来的光线不
16、能 通过小孔，从而产生了消晰度较奇的光学切片效 果。苗于共聚焦显微镜的聚焦厚度薄.在图像分 辨率高的同时也带来了细胞像不完整、突起短而不 连续的问题：虽可通过自身强大的计算机图像处理 功能将不同层面的图像进行磴加来增加图像的信息 含域，但图像耗用极大空间和时间。对于普通荧光 显微镜，位于焦平面外的发射光曲于场光源及光的 散射现彖也能在检测器上形成模糊的图像，因此图 像没有共聚焦显微镜的图像清晰且分辨率不高.但 由于聚焦厚度在物镜40倍时可达数微米，观测到的 是有-定厚度的宽视野平面图，所以细胞像完整，突 起长且连续。434神经郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJ434神经
17、郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJ434神经郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJ434神经郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJl*ig Ili川w himr'ill* I I I >|»uiiil t'onl gmrill of lli«- mt 2 du、l'JI<ning llif rurd hmiiM lion nl Tl 2. UiLimi uilli(i l&M*r Muaiining <NMi(bt'al I ra lh、lhd”l&qu
18、ot;l imnmiwfltl师rtire iiiuigr“ZmFninrtl spinal ronl tUdlie*; B:488 FlmifcMfiii-ldlirltMl iinriiiiiHiniinrr rm * inmgfiiiirtiliii-MaiiKI >pinul i-onlin lliv amr “rr八：(S：iiiki*1 川 jihI II uilli Hu*Ai« u 卜300< :M X .mil II hilh d«»lw pln>hi*li«i|» 7 () Mi(h%acr： (/ Mrf
19、pMl inutge of .uhI B mill lrn；igf J "izrv434神经郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJ434神经郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJKig. 2 Illltiiuiiulluon-M rnr«.“ llir Tl I <»nl M'gmvHl M lllr hl! 2 iluv-lhrlirii|Krt*|«»|)at TI2 hlluH uilli “ inn non BX-60im( niM-i)|N«. I1i<«
20、 lichl m llir4 lhal i»l Fi共. : Trvt> R«mI mi)；(艮尸iirliii<«4nin«Nl |m.ol t oolH ； lm IKK I*inirniiiuH<>niHiir*«< i-im -blmwirig viliK'iilili-Mailinl*pinil ml lissuo in lli- «uiiir an*a (? Mrrgttl<4 jimI II withPIhiIihIm»p 7. () Milluurr； t/：ini
21、agr* of A andII u ill liikigi J434神经郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJ434神经郴訓了杂志 命21总 %4 W） 2（M）5 T 7 JJAilobe photoshop 7. 0 软 ft JI Yj 灵活的选取方 法可识渎广泛的图像搐式提供r分层.通道和路 径等技术便用方便处理能力极强6 Image J是 网络免费提供的用J；£i语舀写成的软件界面简单 但功能强大可以对黑I I和彩色图像进行亮度/对比 度凋整、锐化、裁切等处理.并町用j：阳性标记物的 H数、氏度测址等简单的图像分析本研究将共聚焦显微镜所采集的单标记图像,
22、 经不h ij软件处理后.所获双标记合成图像在品质上 无显弃左异.说明Pholusliop和lniag<* J图像处理软 件在图像矗加方而11有和Fliioviev. FV300软件等同 的功能川普通HX-60荧光城儆诡采集的图像 （卜".2 -（:、）与共聚焦显微镜所采集图像（Fig. I A «）在分辨率加晰度I的差异是原始图像质址 不同造成的用Photoslwtp 7. 0和Image .1软件对免疫荧尢单 标记图像进行无损叠加处理制成XX标记图像既ilf获取多标记荧光图像又叫降低成本.不失为一种好 的荧光图像徨加方法（收觸 2005-01 - 17）参考文献I
23、张森恥 黄比站岗!饱按心技术.冲处解剖学叙蛊.2000； 16：301 -31021抿廡丽荧比显飯鏡技术.细咆3分免疫怜朵恣.1999；15： 124 - 12513> W. n 岭.别衣伦I編.激）t打描共聚您也做术.第版.北京.人民军医岀版*1 . 1997:3 -104j Jing Ml. Kiiam II e Vlnriii I <V at. Expnwion ol itilrmir（liaUw filo* luring iiioiim- l»r；iin Itrlnpinml（:hi” J Pln>n»l Svi. 19<X>I2：I -RI "李ttj. F舲 J朋伦匸稣激比扫描舵聚燻够锻术（第一 版）.北京.人民4CKHJWM . IW7：I3-M6|幼編干鹵设计人门勺捉爲 E 板）.西安两北T业大学册 扳让.2004； 16