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1、动物肝脏 DNA 的制备 、 DNA 的 Tm 值测定 动物肝脏 DNA 的制备一、目的1了解肝脏组织制备核酸 DNA 的方法；2.弄清 DNA 制备的过程中，清除 RNA 和蛋白质的机理 。二、原理1. 根据核糖蛋白（ RNP ）和脱氧核糖蛋白（ DNP ）在一定浓度电解溶液中 溶解度不同，将二者分离。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，并释放 出 DNA ，再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出，达到分离提纯 DNA 的目的。2. 在 0.14mol/L 的氯化钠溶液中， RNP 溶解度大，而 DNP 的溶解度却很 小；相反，在 1 mol/L 的氯化钠溶液中， DNP 的溶解度却很大，从而使 二
2、者获得了分离。核蛋白分离后可用蛋白质变性沉淀剂（氯仿、异戊醇、 十二烷基硫酸钠和热酚）去除蛋白质，释放出的 DNA 用乙醇沉淀，析出 核酸。3. 动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，因此在提取核酸时，尽 量在低温下操作，并要加柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。防止Mg 2+ 、Fe 2+及 Co 2+等激活剂，以便降低核酸酶对核酸的水解作用。三、操作1 抽提取新鲜鸡肝 2g，用 SC 液洗去血液，低温剪碎（在预冷的研钵中操作） ， 加入 4ml SC 缓冲液 , 用玻璃匀浆器匀浆，然后离心 （4000r/min）10min, 倾出上层RNP 层溶液 。向下层溶液中再加入 4ml SC 缓冲液
3、，震荡混匀后再 4000r/min 离心 10 分钟。倒掉上层溶液。2 分离将下层沉淀用 10ml SC 液冲洗并转入 50ml 三角锥形瓶中混匀后， 加入 2ml 5% SDS 溶液，混匀，再加入 7.5ml 氯仿 /异戊醇，边振动边加入 1.15gNaCL 晶体，充分混匀后振荡 30min ，然后转入到 50ml 离心管，于 4000r/min 离心 20min 。小心用吸管由上至下吸取上层 DNA 层溶液于干净小烧杯中。水相蛋白质层氯仿层3提纯加入 2 倍 DNA 溶液体积的 95% 的乙醇，边加入边用玻璃棒沿同个方向缓慢 搅动，当成纤维状 DNA全部绕在玻璃棒取出， 再用 95%乙醇2
4、ml 冲洗干净，再 用 5% 氨水将其溶解。并用蒸馏水定容到 5ml。即为样品溶液。待测样品编号，放置在冰箱中四、思考题1、在核酸提取溶液中，当加入一定浓度 SDS 、异戊醇和氯仿后，得到三层溶 液分别含有哪些主要物质，为什么？2、SC 缓冲液的组成分是什么，该溶液在制备核酸时有何作用，能否用磷酸 盐缓冲液代替？3、如何用紫外法判断 DNA 样品的纯度？ 酵母 RNA 的提取一、目的1了解用浓盐法提纯 RNA 的基本原理和方法。二、原理1. 酵母中 RNA 含量可占干重 3-10% ，DNA 含量很少。因此采用酵母作为 制备 RNA 的原材料。2. 适宜于 RNA 制备的方法有稀碱法、 浓盐法
5、和苯酚法。 前者是用 1%NaOH 溶液，将细胞壁溶解，用酸中和。本实验采用浓盐法提取 RNA ，其机理 是用 10%NaCL 溶液改变细胞膜的通透性，使核酸从细胞内释放出来， 然后升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，除去菌体，再调至 pH 2.5 （RNA 的等电点 ），使 RNA 沉淀出来。三、操作1、提取称取干酵母粉 2g 于 50mL 三角瓶内。加 10% NaCl 溶液 10mL ，搅拌均匀， 然后于沸水浴中提取半小时。2.分离将上述提取液取出，用自来水冷却，分装在离心管内，以 3500r/min 离心 10min ，使提取液与菌体残渣等分离。3.沉淀 RNA管号1234567
6、89101112将离心得到的上清液倾于 50mL 烧杯内，并置于有冰块的 250mL 烧杯中冷 却。待溶液冷至 10 以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性乙醇，随着酸 性乙醇的加入，溶液的 pH 逐步下降，溶液中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5 （RNA 等电点）时沉淀量最多（注意严格控制 pH 值），继续于冰浴中静置 10min ， 使沉淀充分，颗粒变大。3. 冼涤、溶解将 RNA 沉淀液离心（ 3000r/min ） 5min ，去上清，收集沉淀，加入 3mL 0.5mol/L 碳酸氢钠溶液溶解沉淀（ 用玻捧缓慢搅拌沉淀，以助溶解，如有不溶 物则为杂质，再离心去除之） 。得到 RNA
7、 制品溶液，供测定之用。如需要进一 步纯化时，可在冷却下，加入两倍冷乙醇进行沉淀。将沉淀物置 10ml 量筒里，用少量蒸馏水将沉淀物调成糊状， 经充分膨胀后， 再加少量蒸馏水稀释， 然后用 6%氨水调 pH 至 7.0，并暂且定容到 5ml ，测定稀 释 50 倍后的 A260 应控制在 0.6-1.0 之间 ，根据该测定值再次调节待测样品的 体积，作为待测样品。待测样品编号，放置在冰箱中温度（）375060707580859095100100-50100-37保温 15minA260nm0.4870.50.5040.510.5140.5440.5780.5960.6120.5710.5530.492At/ A 260nm11.0271.0351.0471.0551.1171.1871.2241.2571.172数据处理：1.4)1.31.21.1(01062A0.93035 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 温度()管号12340.1% 淀粉溶液（ ml ）1.51.51.51.5稀释唾液（ ml ）0.50.50.50.51% 硫酸铜溶液（ ml）0.51% 氯化钠溶液（ ml）0.51% 硫酸钠溶液（ ml）0.5蒸馏水（ ml ）0.5室温保温 10min碘化钾 -碘溶液（ ml）2222现象