蛋白质下游纯化工艺简介.doc

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1、蛋白质下游纯化工艺简介(总17页)-CAL-FENGHAL-(YICAI)-Company One 1CAL本页仅作为文档封面，使用请直接删除Downstream (下游)与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培 养等的产物表达工序，下游指从表达有H的产物的复杂的混合液中分离纯化 得到符合要求的H的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品 丄业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术 及设备的进步。一、纯化工艺常用衔接技术：1、盐析。常采用硫酸後、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<-20°C) 中可以长期保存。2、等电点沉淀。

2、根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分 级沉淀。4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以 起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的 超滤膜进行超滤。6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升 华为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。7、变性沉淀。根据LI的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的 温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除

3、的方法。例如胸腺肽制备 中使用的热变性(80°C)去除杂蛋白。如果的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱 稳定性不高则不宜采用。8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速 冷冻离心机进行。9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25> G50常用于蛋白质脱 盐。10、过滤澄清过滤、除菌过滤(微米膜过滤)、超滤(1000-300000道尔顿)二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介chromatography,色谱，层析表1常用的液相色谱纯化方法及其原理方法分离原理？?基于凝胶过滤(GF)?分子大小/形 状？?分子形态离子交换色谱(IEX) ?分子

4、所带电荷？?Asp、Glu、Lys、Arg> His 等带电氨基酸疏水作用色谱(HIC) ?表面疏水性？?Trp、Phe、lie、Leu、Tyr> Pro Met> al、Ala等疏水性氨基酸反相色谱(RPC)?表面疏水性？?Trp、Phe、lie、Leu、Tyr> Pro、Met、 al、Ala等疏水性氨基酸金属螯合色谱(IMAC)?分子与金属形 成配位键？?His、Trp、Cys亲和色谱？?特异生物识别 作用?？抗原-抗体，酶-底物，酶-抑制剂等共价结合色谱？?共价结合？?疏基(Cys)1、纯化的一般标和方法首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如

5、：匀浆、离 心、硫酸饮沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。然后进行捕获色谱(capture chromatography),主要LI标是浓缩和去除大量的 容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography) , LI 的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒 凝胶。最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及LI的蛋口的多聚物或 者降解片断，进行精制色谱（polishing chromatography）,常采用具有高分辨 率的凝胶过滤凝胶进行凝

6、胶过滤色谱。2、纯化前的准备工作（1）样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性；b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L硫酸钱中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40°C的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋口水解酶的稳定性。（2）样品预处理a、去除样品中颗粒物（微米膜过滤或者10000 g离心15分钟）b、去除样品中脂类（10000g离心15分钟或有机溶剂抽提）c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）d、抑制样品中蛋口水解酶（加入蛋口酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋 白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）表2

7、样品中有害杂质及去除办法杂质？?害处？?预防措施颗粒 物?堵塞柱子，增大反 压力？?微米膜过滤；10000 g离心10-15分钟；细胞匀 浆,4000-5000 g离心30分钟。脂类？?封闭介质配基、导 致沉淀、导致非特异 吸附？?10000 g离心10-15分钟；若目标分子稳定，用有 机溶剂抽提核酸？?高粘度、封闭介质?加入核酸酶消化，或使核酸沉淀结合位点？蛋白酶降解目的蛋白?？加入蛋口酶抑制剂：用亲和色谱除去蛋白酶；快速 进行第一步分离；低温下进行分离；在蛋口酶缺陷 的宿主中表达重组蛋白山于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行 色谱之前，根据特定色谱方法的要求对

8、样品进行进一步的处理。如下表所示：表3不同色谱方法对于样品的要求样品参 数？?离子交换色谱?？疏水作用色谱？?凝胶过滤色谱样品体 积？?无限制？?无限制？? 一般柱体积的1-5%样品量？?最大理论载量的10-20%?最大理论载量的10-20%?仅受到样品粘度 限制样品粘 度？?约 <50mg/ml?约 <50mg/ml?约 <50-100mg/mlpH值/ 盐浓度？?同平衡缓冲液（低 盐）？?同平衡缓冲液（高 盐）？?仅受介质与样品 稳定性限制有机溶 剂?？为减少非特异吸附，可加 入有机溶剂（30%）?分离后，可用有机 溶剂进行清洗？?仅受介质与样品 稳定性限制（3）样品的保

9、存条件:短期储存（小于24小时）a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋口质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存（数天）8、b、同上C、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋口含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。c、样品复杂度检测HPLC （离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE.等电聚焦、毛细管电泳（CE）。4、蛋白质的来源（1）天然蛋白：天然产物中的目的蛋白一般含量

10、很少而且组分极复杂，在分 离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋口水解 酶的活性。（2）重组蛋白：重组蛋白则H标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达 定位：a、细胞质：在这种惜况下，必须破坏细胞结构才能得到口的蛋口质，同时伴随 着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形 成包涵体，包涵体含有过表达LI的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵 体的溶解与复性是较复杂的。b、外周质：表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样H的蛋白可以较 少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。C、分泌到培养基：这种表达一般蛋口质浓度较低，主要受到培养基中的

11、污染。表4不同来源的蛋口质样品概述来源目的蛋 白含量？?复杂度？?杂质类型？?色谱前预处理天然？?低？?复杂？固体颗粒，杂蛋 白，核酸，蛋白 酶?？去除固体颗粒与核 酸，抑制蛋白酶重组/细 胞质？?较高?复杂?细胞碎片，宿主蛋 白，核酸，蛋白酶？?去除固体颗粒与 核酸，抑制蛋口酶包涵体?很高?低主要为目的蛋白？高速离心分离，溶 解、复性?外周 质？?高？?中等？宿主蛋白，蛋白酶？去除固体颗粒?分泌？?低？低，主要含 培养基蛋白？培养基，蛋口酶， 宿主蛋白?？去除固体颗粒，抑制蛋白酶三、常用液相色谱纯化方法1、凝胶过滤（gel filtration, molecular siee chromat

12、ography 分子筛、size exclusion chromatography 大小剤乍阻色谱，gel permeation chromatography 疑月交渗 入色谱）。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出 峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列，此外还有 Sephacryl> Sepharose% Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简 单、重现性强，目前广泛应用。凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。要点:采用细长（L/D20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。表5常

13、用凝胶过滤用凝胶及其基本参数系列？?名称？?分离范围?？颗粒大小？?应用Superdex prep grade系列？?Superdex 30PG?小于 10000?2444 微术？?小肽Superdex75PG?7300070000?2444 微米？?一般蛋白Superdex200PG?10000600000?2444 微米？?单抗、大 分子蛋白Superose 系 列？?Superose6PG?750005000000?20-40 微 米？?蛋白、多 糖、核酸、 病毒?Superose 12PG?1000300000?20-40 微米？蛋白、多 糖、核酸Sephacryl HR 系列？?Se

14、phacryl S-100?7100010000?25-75 微米？?肽类、小蛋口SephacrylS-200?75000250000?25-75微米?一般蛋白SephacrylS-300?7100001500000?25-75 微 米？?抗体等较 大蛋白?Sephacryl S-400? ?25-75 微 米？?多糖、蛋 白多糖、月旨 质体?Sephacryl S-500? ?25-75 微 米？?<1078bp 的DNA片 断?Sephacryl S-1000?0?40-105 微 米？?<20000bp 的质粒、巨 大多糖、病 毒Sepharose FF 系列？?Sephar

15、ose 6 FF?100004000000?45165 微 米?？质粒、病毒?Sepharose 4 FF?60000?45165 微 米？?病毒， rHBsAg 等 巨大分子Sepharose xB (CL-xB )系 列?？Sepharose 2B?70000?60-200 微米？?大分子复合物?Sepharose 4B?60000?45-165 微 米？?病毒等大分子?Sepharose 6B?100004000000?45-165 微大分子米？Sephadex LH 系列?？?Sephadex LH20?100-4000?730-100 微 米?？天然产物?Sephadex LH60?

16、400-20000?40-120 微 米？?天然产物Sephadex 系 列？ ?Sephadex G-10?小于700?740-120?脱盐及更 换缓冲液用SephadexG-15?小于1500?40-120?Sephadex G-25 coarse?1000-5000?100-300Sephadex G25 medium?1000-5000?50-150?小蛋白、多 肽的分离Sephadex G-25 fine?1000-5000?20-80?Sephadex G25 superfine?1000-5000?10-40?Sephadex G-50coarse?1500-30000?100-

17、300?Sephadex G-50 medium?71500-30000?50-150?般蛋白的 分离Sephadex G50 fine?1500-30000?20-80?Sephadex G-50 superfine?1500-30000?10-40?Sephadex G75?3000-80000?40-120?Sephadex G-75 superfine?3000-70000?10-40?Sephadex G-100?4000-150000?40-120?较大蛋白 的分离Sephadex G-100 superfine?4000-100000?10-40?Sephadex G-150?5

18、000-300000?740-120?大蛋白的 分离Sephadex G-150 superfine?5000-150000?10-40?Sephadex G-200?5000-600000?40-120?大蛋白的Sephadex G-200 superfine?75000-250000?10-40?分离2 离子交换色谱（ion exchange chromatography）蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电 荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有 正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。III于静电相互作用而使样品 结合到凝

19、胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱对于等电点小于的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于的碱性 蛋白质，推荐使用阳离子交换。两种模式：一种使LI的蛋口结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使LI的蛋白不结合 凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。column chromatography （柱色谱）batch chromatography （批色谱）c、疏水作用色谱利用蛋口质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时乂可 以解脱的原理实现分离。d、亲和色谱利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如：酶-底物， 酶-抑制剂，糖蛋口-凝集素

20、，抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱，用 于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋口质以及（His）6-tagged &组蛋 白。亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金 属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。e、反相色谱常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可 以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素（angiotensin）的儿个亚 型通过反相色谱可以很好地分离。同一个样品在同一 Source 30 RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色 谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选

21、择性。四、应用举例例一、一种抗HI gpl20单克隆抗体的Fab片断（中表达）分子量：50 kD等电点：11表达定位:周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离子交换去除大部分杂质，疏水作用色谱 进一步去除杂质，最后用凝胶过滤分离。例二、重组表达的*淀粉酶分子量：kD；等电点：6先采用阴离子交换，再进行疏水作用色谱，最后进行凝胶过滤。例三、重组表达的乙型肝炎表面抗原的分离1、史克公司：（酵母细胞表达）破碎细胞，表面活性剂抽提，离心沉淀、超滤，再经凝胶过滤、阴离子交换， 超速离心纯化，脱盐，除菌过滤，吸附，分装。2、Merck公司：（酵母细胞表达） 破碎细胞，去碎片，抗原用

22、多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，屮醛处理，明 矶吸附，疫苗。3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）培养上清液，离心去碎片，50%硫酸钱沉淀，离心，50%KBr处理，脱盐、超滤 浓缩、Sepharose CL-4B凝胶柱分离。4、Below, M. Bioseparation. 1（1991）. 397 工艺破细胞，去碎片，加硫酸钱至一定浓度后，直接上Butyl-Sepharose 4 FF疏水 柱，脱盐后上DEAE-Sepharose FF,超滤浓缩后上Sepharose 4 FF凝胶过滤柱。例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离（注射用降纤酶）分子量：38 kD；等电点：原工艺：阴离子交换，凝胶过滤

23、，第二次阴离子交换，凝胶过滤达到95%以上纯度，产量6000-10000单位/克蛇毒。俩周）新工艺：亲和色谱，阴离子交换，凝胶过滤，亲和色谱（一周）纯度达到以上，产量达20000-25000单位/克蛇毒。尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后，获得了单成分降纤酶组分，电泳为一 条带，HPLC为单峰。如上图所示，由于每一个步骤均会带来一定的损失，故在可能的情况下应尽量 减少下游纯化的步骤（在保证达到所需纯度的前提下）。重组蛋口纯化的基本策略一、融合表达蛋口的纯化:融合表达蛋tl可以在原口标分子之外带有GST肽段或（His） 6肽段，从而使得 可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或

24、Chelating Sepharose凝胶进行亲和色 谱分子，一步可以达到90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及 高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（9599%） o二、包含体表达蛋口的纯化：在系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组 分分离，但需要注意的是蛋口复性的步骤。一般采用盐酸弧溶解包含体蛋口 后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝 胶可以促进蛋白质的复性的报道）。以下以rhGM-CSF （重组人粒细胞-巨噬细 胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸弧溶解包含体蛋口，

25、作1： 70稀释使蛋白复性，加硫酸鞍至一定浓度后，上样于Phenyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharose FF进彳亍离子交换，最后上 Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM- CSF, 同时，DNA及内毒素去除率均很高。如下表所示：步骤？?体积(ml)? 蛋白(mg) ?内山素(EU/ml) ?DNA(pg/ml)起始（复性样品）？?4344?490?421?180HIC疏水柱?880?220?243?AIEX阴离子交换？?620?88?251?GF凝胶过滤？?1045?62?9 三

26、、周质表达的蛋口的纯化:可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直 接上柱（STREAMLINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。各种色谱的上要影响因素一、凝胶过滤色谱：一般来说，凝胶过滤色谱的结果好坏直接取决于凝胶柱的柱效（每米多少理论 塔板数），而影响柱效的因素主要有：1、凝胶本身性质：每一种凝胶均有其合适的分离范围，应选择合适的凝胶进行分离。同样分离范 围的凝胶颗粒越细的，柱效越高。2、色谱柱装填的好坏：凝胶过滤色谱柱装填完后，一般可以用丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性， 一般对于平均颗粒直径在3034微米的Superose PG、Superdex PG

27、系列凝胶， 柱效应在9000以上，而颗粒平均直径在90微米的Sepharose FF凝胶柱效应在 3000以上。通常，越是分辨率高的细颗粒凝胶对于装柱的技术要求越高。除了柱效以外，影响分离的因素主要有：a、色谱柱的长短，一般较长的柱分离较好，L/D>20o但一般商用色谱空柱长 100cm左右，最多可以装到9095cm高左右，如果仍不能取得满意的分辨率， 可以用两根相同的凝胶柱，用SRTC-2接头连接后，可以提高分辨率40%。分离度正比于柱长的平方根。b、样品浓度，在蛋口浓度小于50mg/ml并且粘度小于5cP （厘泊）的条件下， 样品浓度对于分辨率影响较小。c、上样体积：上样体积越小分辨

28、越好，不同的凝胶具有不同的推荐上样体积，如下表：凝胶类型？?推荐上样体积（t）Sephadex?2-5%Sepharose?2-5%Sephacryl HR?l-2%Superdex PG?l-2%Superose PG?l-2%Superdex?%Superose?%对于利用Sephadex G25进行蛋口质脱盐的特殊情形，样品量达到柱体积的25% 仍可以保证蛋白与盐分开。d、洗脱流速:般较低的流速下(510cm/h)分辨率较高,但Superdex PG, Sepharose FF等 新型凝胶可以在较高的流速下分离而不致损失分离度。二、离子交换色谱：a、凝胶本身的性质：分辨力 Sepharo

29、se FF<Sepharose HP<Source 30<Sourcel5 (基架)DEAE：弱阴离子Q：强阴离子选择性有差异CM：弱阳离子S：强阳离子选择性有差异b、工作缓冲液的pH值：离子交换依赖于分子所带的电荷，故pH对其影响较大，往往pH的改变就足 以改变色谱结果，具体对于分离某一种蛋白，那一个pH最合适，需要进行大 量的实验摸索。c、上样量：一般保持在结合最大容量的20%以下可以获得较好的分辨率。但对于样品体积 无限制。d、梯度形状：梯度越平缓，分辨率越高，但同时样品越稀。c、流速：影响不大。三、疏水作用色谱:a、疏水凝胶本身的性质：基架：Sepharose FF&

30、lt;Sepharose HP< Sourcel5取代基疏水性：Phenyl苯基、Octyl正辛烷基、Butyl正丁基、Ethyl乙基、Iso异 丙基均不相同，选择性也不同。相同的取代基，不同的取代程度：如Phenyl Sepharose 6 FF (Low sub)与 Phenyl Sepharose 6 FF (High sub)疏水性不同，选择性也不同。b、盐类：一般常使用硫酸镀、硫酸镀，其他盐类也可使用，具体应根据实验情况决定。c、温度：温度升高，疏水作用增强。d、pH值：在接近中性的范围内，影响不大。e、样品体积：无影响。f：流速：在压力许可下，无明显影响。即样品浓度：在粘度不

31、超过5cP下，无影响。h、梯度：较缓的梯度分辨较好。四、一些蛋口质的分子量与Stokes半径:蛋白质？?分子量(kD) ?Stokes 半径(nm)乳清蛋白？核糖核酸酶 ?肌红蛋白？ 大豆胰蛋口酶抑制剂？ 碳酸酹酶?辣根过氧化物歧化酶?？40?卵清蛋白？?45?血红蛋白(人)? 牛血清白蛋白?？70?酵母醇脱氢酶？?150?血浆铜蓝蛋白？?151?谷氨酸脱氢酶?？258?甲状腺球蛋白?？670?芜菁花叶病毒？?3500?凝胶过滤色谱柱装填完后，一般可以用丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性, 一般对于平均颗粒直径在3034微米的Superose PG、Superdex PG系列凝胶， 柱效应在

32、9000以上应该这样test儿点补充：1、凝胶柱，假如进行的仅是“组别分离"，则不测柱效也没关系，比如采用 Sephadex G-25对蛋白样品脱盐，或者U的蛋白与杂质分子量相差10倍以上。2、需要高分辨的分离，杂质和LI的蛋口相差2倍以下，则柱效高才有分离很好 的把握。3、测量柱效的方法，一般采用1%丙酮或lmol/L NaCl作为样品，进行分离（上 样体积与所用凝胶种类相关），AKTA系列液相色谱仪可以自动在积分后得岀每 米的塔板数。我在做一个包含体复性的蛋口纯化，用的是GST purification Glutathione sepharose 4B.可是发现：在蛋口和凝胶哺育

33、半小时装柱后，我的蛋口还是很多 在没来及用elution buffer,只用pbs洗柱子的时候就脱下来了，不知道是怎么 回事啊，是不是盐浓度太低？儿点补充:1、凝胶柱，假如进行的仅是"组别分离"，则不测柱效也没关系，比如采用 Sephadex G-25对蛋白样品脱盐，或者U的蛋白与杂质分子量相差10倍以上。2、需要高分辨的分离，杂质和LI的蛋白相差2倍以下，则柱效高才有分离很好 的把握。3、测量柱效的方法，一般采用1%丙酮或lmol/L NaCl作为样品，进行分离（上 样体积与所用凝胶种类相关），AKTA系列液相色谱仪可以自动在积分后得出每 米的塔板数。液相色谱仪还有塔板数

34、什么的东东是什么样的我用的AKTA的柱子和介质但 好像没有那个东东。另外怎么使一个凝胶柱装的比较好呢比如说superose 12PG , 装的是16*40的柱子！ ！wenlee wrote,我在做一个包含体复性的蛋口纯化，用的是GST purification Glutathione sepharose 4B.可是发现：在蛋口和凝胶哺育半小时装柱后，我的蛋 白还是很多在没来及用elution buffer,只用pbs洗柱子的时候就脱下来了，不 知道是怎么回事啊，是不是盐浓度太低？你复性后的样品buffer是什么呢？盐浓度应该不会影响binding的。pH 般, 所以常用的pBS都可以bind

35、ing的。在样品加到胶上前，胶需用PBS平衡至少3次，然后再加样品。如果你的样品处理过程或是样品buffer会影响GST-tag的构象，就有可能影响 binding,我的感觉是GST胶效率并不是非常高。你说PBS可以洗下来，那么用GSH的elution buffer洗下来了么跑SDS-PAGE看 目的蛋白在wash buffer里，elution buffer里各占多少呢如果用GSH仍可以洗下来一部分口的蛋白，那么前面的损失可以考虑延长 incubate的时间，或是在上一次胶，如果不结合，那说明这部分蛋白的GST构 象不对，这样就需要考虑你的样品提取以及复性过程是否有要改进的地方了。Amers

36、ham的AKTA系列蛋口纯化仪就是一台中低压的制备色谱仪，包括泵， U/is, pH probe, cond 等组件，流速比 HPLC 的要大很多，purifier-100 和 explorer- 100主要用于实验室规模的制备，有时也可用于某种分析应用，最高压力 lOMpa,用于常规的蛋白质纯化是足够用了。塔板数的概念很容易找到，就是借鉴化工中精馆的思想，把传质的概念运用到 色谱中，这样可以在某种条件下，衡量色谱填装的好坏，也就是柱效的高低， 其实色谱是个经验性很强的东东，而且Acetone测定的柱效并不能完全反映大 分子在柱内的不断分配和平衡，比如腺病毒大分子用XL的胶分离反而比FF和 H

37、P的胶有更高的柱效。AKTA制备层析仪的工作站Unicorn可以根据采集到峰图数据，自动计算塔板 数，非常方便，可以通过HETP和As对于装柱进行指导，还是很有意义的。Bio-Rad也有类似的仪器，还包括早期的phamacia &LKB的仪器，其实原理都差 不多，只是现在做得越来越方便，功能越来越多。你没有仪器，可以用国产的恒流泵或蠕动泵来做，不过前者压力可以较高（北 京卫星厂的可以到8MPa）,蠕动泵耐受压力较小。然后接上国产的U和记录 仪来做。测柱效方法是一样的，不过要用尺子在记录纸上量了，加快走纸速度 可以减小误差。也可以买一套较便宜的N2000工作站，带数据釆集卡的，也可以。你

38、的SEC柱用16/40柱子不大合适，短了些，建议用的柱子，至少16/70, 保证较好的分辨率。装柱要先把胶在室温平衡，混匀，脱气后，一次性倒入柱 中，不要有气泡，amersham的录像可以看看作参考。儿点补充：1） AKTAexplorer系列非常适合做工艺开发、中试，甚至是某些产品的大规模生 产。假如某些药一个剂量在ug水平的话。小龙最近开发了某二类新药的大规模纯化工艺，使用AKTAexplorerlOO,年产能 可以达到5001000万剂。2）一般常规液相色谱，凝胶柱需要比较注意装柱效果和柱效，而离子交换柱、 亲和柱、疏水柱、反相柱则一般装均匀就可以了。但是HPLC的反相柱、离子交 换柱等

39、还是柱效越高峰分离越好。3）Superose 12 PG为常规凝胶过滤介质中价格比较高、性能比较好的品种（400多美金/125ml）,对于装柱要求比较严格。其比较好的分离范圉为 1000300000 Da （对蛋白，对核酸完全不同），完全排阻分子量为200万。理 论上说这样粒径在30微米左右的胶，每米的理论塔板数达到1万以上才算柱子 装得比较好。装在16/40的柱子内，柱高最多30多厘米（借助装柱器），对于 一般的凝胶过滤来说，柱高稍微短了一些，除非你有把握柱子装得非常好，柱 效非常高，或者分离本身不需要很高的分辨力，否则建议使用较高的柱子，比 如XK16/70或XK16/100o （安玛西亚

40、预装的30厘米高的Superose 12柱，柱高 仅30厘米，不过柱效达到40000/米以上，故分辨能力极佳，可以用于代替一 般的HPLC凝胶柱）5）另外，假若多次试验表明柱子分离你的样品得到很好的分离，纯度满足你的 要求，则无需关心你的柱子柱效是多少，够用就行了。可否见告你所使用什么泵带柱子要分离的U的物和杂质分子量的基本情况谢谢两位的帮助！哇塞，Superose 12 PG那么贵呀，我是从我们科室一大箱 子乱乱的药品中发掘出来的，呵呵，大发现呀！：）：）to小龙：泵带柱子？不好意思我不明口是什么，我使用的是那种恒流泵，柱子 是Amersham的带套管的，装好后的确就35cm 了，LI的蛋白

41、是万左右的分子 量，在SDS-PAGE观察的杂蛋白大约万的有几条吧,都很淡,是经过DEAE- Sepharose FF分离后得到的。的确如你所说过了 Superose 12 PG后效果不是太 好！但这个柱子还是借的人家的哪，好象再长的就没了吧，我原来用G75做 过，效果也好差，这样装才能装的好呢？ 再次感谢您们的帮助！ 按照你说的情况，目的蛋白万，杂蛋白6万，则Superose 12 PG非常不合适, 比较合适的凝胶是Superdex 75 PG （较贵）或Sephacryl S-100 HRoSephadex G-75也是可以的，只是柱效稍低，但是你的问题是柱子咼度太小，最 小也得在6070

42、厘米左右，我一般做凝胶柱都是用柱高100厘米的空柱装到 9095厘米柱床高度。国产的仿制安玛西亚的空柱好像儿口元一根，虽然我感觉不好用，但是装90厘 米总比装30多厘米分辨率要高吧。安玛西亚XK16/100的柱子价格大约数百美元，而且要装好还需要同样需要儿白 美元的装柱器。此外，SDS-PAGE上目的蛋白分子量和杂蛋白分子量差别大，有时不一定凝胶柱 能够分离很好，因为在natie状态，存在分子聚合的很大可能。有条件，你跑一个非还原-SDS-PAGE和natie-PAGE假若口的带和杂蛋白带仍然 明显分开，则凝胶柱分离分开的可能就很大了。你说12 PG的分离范圉对于我的蛋白的情况不适合是吗G 7

43、5的流速要求是不是 非常低16mm内径的柱子，流速才左右对吧（3cm/h）柱高75cm左右的话一个柱 体积岂不要25个小时！ ！以前我用G75的时候没有注意流速的要求，可能都 达到了 15cm/h 了吧，流速的要求很严格吗多谢您多次的帮助！Sephadex G-75流速达到1015cm/hour,只要你的泵能够达到这个流速并保持 稳定，此外柱床高度保持稳定（柱顶不被压下），则是可以接受的（分辨力可 能稍有下降）。其说明书介绍的最大线流速为77cm/h,当然可能是在很低的柱床高度下测定 的。假如是Sephadex G75 superfine,则流速要低许多。假如采用自然流速，一次典型的凝胶柱分离

44、耗时十儿20小时是很正常的。我的经验Superdex 75 PG,流速达到2030cm/hour,分辨率尚很好。你好小龙，请问你是否知道关于Dextran T70的一些常识，看着包装是 phamasia的，但查了法马西亚的资料档案，没有Dextran T70的说明书。我的 蛋白情况和liugy04的很相近，（訂的蛋白万，朵蛋口 45万左右，）不知道 用Dextran T70合适不合适Dextran T70不是用于分离纯化蛋口质的。据我手头的少许资料来看，他是一种 平均分子量为70000左右的Dextran （由部分水解后分离得来）。其用途基本为："For use as media s

45、upplements* in enhancing rosette formation, in enhancing immune precipitation and in cryoprotection of cells".大约是一种细胞培养使用的培养基添加物。我没有使用过。具体你可到安玛西亚的网站上搜索其使用说明书。 你的H的蛋tl万，杂蛋白主要45万，假若H的蛋口在natie状态下不形成二聚 体，应该还是可以较好分离的。凝胶可以选用Sephadex G-75 (最便宜)、 Sephacryl S-100 HR Superdex 75 PG (最贵)。你应根据你实验室的具体条件来选择最合适的凝胶(性价比)。1KD 等于 1000 dalton.我的意思是：以Sephrose CL4B为例，测定某个大分子的KD值KD=(e-o)/(t-o)假 如说KD二时的分子大小是多少Dal