《实验一物染色体压片技1..doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验一物染色体压片技1..doc（9页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、实验一植物染色体压片技术一、实验原理 :植物染色体压片技术是利用化学或物理的方法 ,将具有分裂能力的细胞保持原 有的分裂状态 ,并对其染色体进行染色 ,压片后观察它的染色体分裂的一种方法。二、实验目的 :植物染色体压片技术是细胞遗传学和细胞分类学等研究中应用最为普遍的基本 技术 ,是其他新技术所不能完全取代的 ,是从事染色体研究的工作者首先应该掌握的 一项基本的实验方法。三、材料的制备 :黑麦根尖 (2n=14根尖材料的制备 :1. 浸泡:大、油、壳浸泡 24h(2325;小、裸的不浸泡。2. 发根:将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养 (锯木屑、土壤、砾石、麦 杆、谷草 ;最适温度 (23
2、32;培养 24h再放入 04冰处理 17天。目的 :(1 使分 裂速度减慢 ,根尖长度整齐一致 ;(2 调节工作时间。再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养 12天; 待根尖长度为 1.52Cm 即可处理。3. 愈伤材料的制备 :(适合春、夏两季用刀片将树杆割去保护组织露出伤口 ,用 75乙醇消毒包裹一天 ,再用 5075ppm赤霉素处理 ;几天后长出白色幼嫩的愈伤组 织即可固定。四、预处理 :1. 方法:（化学和物理两种（1 化学方法 :（适合所有生物a. 秋水仙素 0.050.2 （白色粉末 ,易溶于水的巨毒药品 ;b. 0.002M 8-羟基喹啉 （淡黄色晶体 ,用少量的乙醇溶解
3、再稀释 , 对禾本科植物的随体表现很清楚 ;C.-溴萘饱和液 （淡黄色的乳浊液 ,易溶于乙醇和苯 ;难溶于水 ,100ml 水中倒入 12滴剧烈的振动 5分钟;（以上 abc三种药剂在 1518温度下处理 35hd. 对二氯苯饱和液 （淡黄色的晶体 ,难溶于水 ;具有强烈的腐蚀 性,只能处理 11.5h。（2 物理方法 :（适合禾本科作物 ,本次实验所采用 冰水混合物在 04温度下处理 24h。预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成 ;增加中期图象 ,改变细胞质的粘度 ,使染色 体缩短变粗 ,易于染色体的显带及研究。五、固定 :卡诺氏 31 （乙醇醋酸 ;卡诺氏 631 （53 2（乙醇氯仿醋酸 ;
4、 固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞 ,使之保持细胞中的染色体处于 被固定前的原有状态。六、保存 :冲洗置换 ,从 95 70的乙醇梯度置换 ;每次置换需停留2030min,目的是将固定液中的醋酸从材料中置换掉 ,最后将材料保存在 70的 乙醇中备用。七、解离 :（酸解、酶解1、1mol/HCl 在 60水浴中处理 510min;2、0.2mol/HCl 在 25水浴中处理 11.5h;3、酶解纤维素酶 +果胶酶。解离的目的使胞间层的果胶类物质解体 ,利于细胞分散 ,有助于压片 ;同时解离也 可适当清除部分细胞质 ,使细胞质背景趋于透明化 ,便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶
5、解法。八、染色 :1、0.5的醋酸洋红 ,530min;2 锡夫试剂、减性品红、石炭酸品红。染色的目的是为了更好的鉴别染色体。本次实验用的染料是0.5的醋酸洋红。九、制片 :制得 10 张分裂相好的片子 ,保存在片盒内 ,以备显带实验所用。十、揭片:将制片在未干燥之前 ,在-176液氮中冷冻 5070 秒,取出后迅速地揭片。实验二植物染色体去壁、低渗、火焰干燥制片技术一、实验原理 :用此法可以显著提高染色体的分散程度和平衡性 ,可以减少染色体的变形、断 裂等现象 ,也可以减轻细胞质对染色体的覆盖。使染色体各组成部分 长臂、短臂、着丝粒、随体、染色单体等都显示得比较清楚 ,有利于染色体测量和显带
6、的分 析。此法也很简单 ,首先用酶解法去除植物细胞壁 ,再利用热胀冷缩的原理 ,将植物细 胞在冰片上用火焰烧烤 ,用力甩片能使细胞膜破裂 ,不需要特殊设备 ,同时也省去了繁 杂的压片手续 ,显著提高了制片的效率。二、实验目的 :学习植物染色体标本制备去臂、低渗法的技术 ,为染色体显带实验提供了优良 的标本。三、实验步骤 :1、分生组织材料的制备 :需要量大 ,方法与第一次实验相同。（对于不容易压片技术的材料可用该种方法。比如小染色体或多染色体、以及 机械组织含量高的和木本植物的根尖等。而比较珍稀的材料或容易制作的材料可不 用此法。2、常规处理 :分为活体材料和离体材料两类。本实验采用离体材料,
7、用物理的方法进行预处理。 （方法与上次实验相同。 （活体处理 :前低渗 :加入 0.075mkcl前低渗液,在 25下处理 30分钟。作用:让kcl渗入到细胞中 ,细胞浓度加大 ,细胞内的水分渗透出来 ,便于后面实验步骤的药剂顺利进入细胞。后面的实验步骤与离体材料的相同3、解离:将根放在 0.2MHCL 中,在25下浸泡 1h。作用:以软化细胞壁 ,去除细 胞壁之间的果胶质。4、前低渗 :用自来水冲洗材料 ,再用 25的蒸馏水浸泡 0.5h 作用:可置换出细胞 内的 HCL, 使细胞充分吸水。染色体在细胞内处于游离状态 ,在制片时便于染色体分 散。5、酶解去壁 :倒掉蒸馏水 ,加入 2%的纤维
8、素酶与果胶酶的混合液 ,在 35-37下 处理 1h。作用 :对细胞壁所含的纤维素、半纤维素和果胶质进行消化。6后低渗 :用镊子夹住根部抖落分生区 ,将其它部分丢弃 ,收集分生区组织 ,转入指 形管,沉淀 10min后吸出酶液 ,加蒸馏水浸泡 0.5h。作用:可置换出酶液。使细胞充分 吸水膨胀 ,染色体游离在细胞质中 ,制片时便于染色体分散 ,是关键步骤。7、固定 :吸去蒸馏水 ,加 31的甲醇固定液 ,静置 15min。作用 :置换出细胞内的 水分 ,便于燃烧。 （甲醇固定液作用有 :具有一定的脆性 ,甩片时容易使细胞膜破 裂。 2能改善染色 ,有助于以后实验时的吉姆萨染色。8、制备悬浮液
9、:吸去上清液 ,以 110的比例加入新鲜的固定液 （即一份细胞 ,10 份固定液 ,用吸管不停的吸放以捣碎组织 ,制成均匀的细胞悬液。9、标本片制备：将冷冻的载玻片斜放 30-45角°，点上酒精灯， 吸 2-3 滴细胞 悬液在该片上，加热烧烤，此时用力甩片，制作10 张标本片。实验三 植物染色体 GiemsaC 带技术 一、 实验原理： 染色体显带技术是借 助于特殊的处理程序，使染色体显现出深 浅不同的染色带。染色带的数目、部 位、宽窄与浓淡具有相对的稳定 性。从而在以往染色体形态特征（长度、着丝粒 位置、臂比、随体等） 以外又增添了一类新的标志。染色体分带技术能有效地鉴 别染色体，
10、 研究染色体的结构与功能。 C 一带是植物吉姆萨分带的一种类型，是 染色体经过 C 一带程 序处理，使染色体着丝粒两侧出现带纹，故名 C 一带。 二、 实验目的： 掌握植物染色体吉姆萨分带技术和方法。 三、实验步骤： 1、制片： 选取前两次实验 （压片法、去壁低渗法制备的片子各 10 张。 2、干燥：两种方法 自然干燥 松树、洋葱 15 天， （不超过 3 过月；禾本科作物 215 天。无水乙醇 干燥 只需要 112 小时即可。 （目的：染色体具有后熟的作用；去除染色体上 的蛋白质； 使材料凝固在片子上。 本实验采用自然干燥方法。 3、酸处理：两 种方法 用 45%醋酸在时温下处理 11.5
11、h； 用 0.2MHCl ，在时温下处理 1 1.5 h， 或 25下处理 1012min； （处理完毕用，用 30的蒸馏水过一次）作用：去除 制片上的杂 质和染色体上的蛋白质；破坏细胞质；使第一 次染色褪色。与染色体上的 DNA 或某些减基结合，使染色体 上不同程度减基脱落，有助于程度不同的显带。 应选用种方 法。 （酸处理是变性的过程。应注意控制时间，如果处理恰倒好 处感 觉染色体饱满，带纹丰富；如果处理不够，染色体上的色 差不明显，观察不到带 纹；如果处理过度，染色体很薄，带纹 也不丰富。 4、减处理：两种方法 强减 NaOH、KOH ；室温处理，不得超 过 20 秒；（大约 15 秒
12、弱减 Ba（OH2 饱和溶 液，在 25下 处理 10-12min。减处理也是使染色体变性的过程，作用是与染 色体 上的 DNA 减基结合，消化 DNA 。处理完毕不能直接倒去减 液，以防止 Ba（OH2 与空气中 CO2 结合生成的碳酸钡薄膜覆盖在 制片材料的表面，影响后续工作的正 常进行，所以必须用流动 的自来水冲洗， 以去除表面的薄膜以及水中的沉淀物 ,冲 洗完毕 用 30蒸馏水漂洗浸泡几分钟，置换出减液。 5、盐处理：用 2 ×SSC 盐溶 液（0.3MNaCl+0.03MNaC6H5O7 2H2O， 在 60下处理 1.5h。盐处理是使染色体复 性的过程，作用 （1 调节 PH 值；（2修饰 DNA 上的减性基团和酸性基团。 1.5h 后 倒 去盐溶液，加入 30蒸馏水浸泡几分钟，置换出盐溶液。 6、染色：取吉姆萨母液 （1浓度 10-15ml,用磷酸缓冲液 （PH6.8-7.2 稀释至 1000ml（比较新鲜的母液 15ml, 氧化 1 年以上的母液 10ml） 。在 25下染色 80min