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1、全反式维甲酸增强骨形态蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化作用研究黄 帆1，刘映孜2，杨秋珺2,周龙洋2，周岐新2，罗进勇3，何百成2, 邓忠良1 （400010 重庆，重庆医科大学附属第二医院骨科1；400016 重庆，重庆医科大学药理教研室2，重庆医科大学检验学院3）摘要 目的 研究全反式维甲酸（ATRA）对骨形态蛋白9（BMP9）诱导间充质干细胞成骨分化的影响及可能机制 方法 采用采用组织化学染色检测处理后第5、7天各组第5、7天碱性磷酸酶活性变化，。Western blot方法检测第9、11天各组第9、11天骨桥素蛋白表达水平及Smad1/5/8磷酸化水平，。茜素红染色检测第14、20天各组
2、第14、20天钙盐沉积水平，。采用Western blot检测各组Smad-1/5/8蛋白磷酸化水平，以及用萤光素酶报告质粒检测BMPR-Smad信号通路的活化程度。结果 ATRA及BMP9均诱导C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶活性升高，但ATRA合并BMP9组碱性磷酸酶活性明显强于单用ATRA或BMP9组组；Western blot结果显示，BMP9合并ATRA组骨桥素蛋白表达水平高于BMP9组；钙盐沉积染色结果表明，BMP9合并ATRA组钙盐沉积染色也明显较单用于BMP9能明显促进钙盐沉积组。机制分析结果显示，BMP9合并ATRA组Samd1/5/8磷酸化水平明显强于单用BMP9组，BMP
3、R-Smad报告质粒萤光素酶活性也呈相同变化趋势明显强于BMP9组（P<0.01），Samd1/5/8磷酸化水平也呈相同变化。结论 ATRA能增强BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的作用，其机制可能与ATRA促进Smads信号转录转导活性有关。关键词 全反式维甲酸；骨形态蛋白9；间充质干细胞；Smad信号中图法分类号 R681.1 文献标志码 A通信作者 邓忠良，电话：（023）63693558， E-mail：deng7586Research on the effect of all-trans retinoic acid enhance the osteogenic differen
4、tiation induced by BMP9 in mesenchymal stem cellsHuang Fan1, Liu Yingzi2, Yang Qiujun2, Zhou Longyang2, Zhou Qixin2, Luo Jinyong3, He Baicheng2, Deng Zhongliang1 （1Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China；2Department of Phar
5、macology, Chongqing Medical University, Chongqing，400016, China; 3College of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing， 400016, China, ）Abstract Objective To investigate the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) on the osteogenesis induced by bone morphogenetic protein 9 (BMP9)
6、 in mesenchymal stem cells (MSCs) and to dissect the possible mechanism underlaying this effect. Methods This research employed histochemical staining to test the alkaline phosphatase (ALP) activities when treated the C3H10T1/2 cells with BMP9 and/or ATRA for 5 or 7 days. Then, evaluated the express
7、ion protein level of osteopontin by Western blot onwhen treated the C3H10T1/2 cells with BMP9 and/or ATRA for D9 and or D1111 days, so did the mineralization with Alizarin Red Staining on for D14 and or D20 days. Finally, analyzed the activation of BMP-Smad signaling with BMPR-Smad binding site luci
8、ferase reporter assay and Western blot to determine the phosphorylation level of Smad1/5/8. Results The activities of ALP are increased by BMP9 and/or ATRA, but the ALP activities of BMP9 combine with ATRA group are more pronounced than that of BMP9 or ATRA alone. ATRA potentiates the osteopontin ex
9、pression and the mineralization induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells. ATRA promotes the phosphorylation level of Smad-1/5/8 and increases the luciferase activity of BMPR-Smad luciferase reporter. Conclusion ATRA can potentiate the osteogenesis induced by BMP9 in mesenchymal stem cellsMSCs, this maybe
10、mediated at lease by increasing the BMP-Smad signaling activationtransduction.Key words All-trans retinoic acid; Bone morphogenetic protein; mesenchymal stem cell; Smad signalingCorresponding author: Deng Zhongliang， Tel:86-23-63693558，E-mail:deng7586骨折、骨缺损及骨不连接是临床常见的骨科疾病，目前的治疗方法并不能达到理想的治疗效果。组织工程骨是治
11、疗这类疾病的理想材料，间充质干细胞是组织骨工程中的理想种子细胞，但如何有效促进种子细胞骨向分化是该领域的研究热点之一1。骨形态蛋白9（BMP9）属于转化生长因子超家族的成员之一，目前认为BMP9是诱导干细胞成骨分化能力最强的因子之一，多种因子能影响BMP9诱导干细胞成骨分化2-4。因此，寻找能促进BMP9诱导干细胞成骨分化能力的因子对组织骨工程发展具有重要意义。全反式维甲酸（ATRA）能促进多种前体细胞分化，已成功用于急性早幼粒细胞白血病的治疗5。但ATRA对干细胞成骨分化的作用存在争议6-8，本课题组前期研究发现ATRA能抑制人骨肉瘤细胞生长，其机制可能与促进人骨肉瘤细胞骨向分化有关9。本研
12、究旨在明确ATRA对BMP9诱导干细胞成骨分化的影响，为进一步增强BMP9诱导干细胞成骨分化寻找一种新的方法，以利于组织骨工程发展和提高临床相关骨疾病的治疗效果。1 材料及方法1.1 试剂及细胞培养 间充质干细胞C3H10T1/2购自美国标准培养收集所，全反式维甲酸（ATRA，购自BIMOL），采用DMSO作为溶剂（北京索宝来科技有限公司），碱性磷酸酶染色试剂盒购自Sigma-Aldrich公司（Cat # 85L-2），实验所用抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司，茜素红（Alizrin Red S）购自成都格雷西亚化学技术有限公司，油红O（Red-Oil O，购自
13、Amresco公司），Lipofectamine 购自Invitrogen公司，用DMEM培养基（高糖）培养细胞（含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素及100 g/mL的链霉素），细胞培养条件：5% CO2及37 。1.2 构建表达绿色荧光蛋白和BMP9的重组腺病毒本实验所用重组腺病毒均采用Ad-Easy10系统构建，由芝加哥大学T.C.-He核实姓名写法（何通川）教授提供。构建方法：从EST克隆中用PCR将目的基因的编码序列扩增，然后克隆到穿梭质粒。最后将穿梭质粒线性化并与含腺病毒骨架序列的质粒进行重组，将重组正确的质粒线性化并转染到HEK-293细胞（human embryonic
14、kidney-293）进行病毒包装，得到目的基因编码序列的重组腺病毒，即GFP重组腺病毒（Ad-GFP）和BMP9重组腺病毒（Ad-BMP9）。1.3 实验分组 分为ATRA处理组、Ad-BMP9处理组及ATRA合并Ad-BMP9处理组，以DMSO合并Ad-GFP处理为对照组。将细胞铺于24或6孔板几孔板？时，初始密度为30%，重组腺病毒感染效率为20%。1.4 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色将细胞种于24孔板，按实验分组加入相应处理因素，分别于第5、7天进行ALP染色。ALP染色按试剂盒操作说明进行。1.5 Western blot检测骨桥素（osteop
15、ontin, OPN）表达及Smad-1/5/8磷酸化将细胞种于6孔板中，待细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素。于第9、11天提取各组总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度。用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按常规方法进行Western blot操作。最后采用ECL化学发光法显色，使用凝胶成像仪成像。每组实验重复3次。1.6 茜素红染色检测钙盐沉积参照文献11，将细胞种于24孔板，待细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素，于给药后第14、20天染色。用2.5%的戊二醛固定10 min，吸去固定液后用PBS（pH值为4.2）清洗2次。用2%的茜素红染液处理细胞20 min，然后用上述PBS清洗2次。
16、每组实验重复3次。1.7 萤光素酶报告质粒实验检测BMPR-Smad信号的转录活性将细胞种于T25培养瓶中，待细胞贴壁后利用lipofectamine转染3g BMPR-Smad结合位点报告质粒（BMPR-Smad Binding Sites reporter, p12XSBE-Luc。 该报告质粒是以Smad-1/5/8与DNA结合的序列为基础建立的）12，4 h后换液。12 h后将细胞消化并种于24孔板中，待细胞贴壁后，按实验分组分别感染Ad-GFP、Ad-BMP9，并加入相应浓度的ATRA。24 h后裂解细胞并按照试剂盒说明进行萤光素酶活性测定。BCA法测定细胞裂解液总蛋白浓度，用于对萤
17、光素酶活性进行校正。每组实验重复3次，结果取平均值。1.8 统计学分析采用Excel 2003进行统计分析，数据以±s表示，t-test进行组间比较。2 结果提供各小图原始图片格式文件，要求像素在400万或以上，压缩包附件提供2.1 ATRA促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性升高BMP9组ALP染色较对照组深（D7的染色结果更明显）；单用ATRA组ALP染色较GFP对照组有所增加，但不如单用BMP9增加明显；BMP9合并ATRA组ALP染色明显较BMP9组和ATRA组深（图1）。提示ATRA对BMP9诱导的间充质干细胞ALP活性升高具有明显促进作用。 对照组 BMP9组
18、 ATRA组 BMP9+ATRA组第5天第7天图1 ATRA促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增加 (A)：ALP染色，（；B）：定量分析。 “*：”P<0.05 vs 对照组，“，*”：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.01，与BMP9组比较图1 ATRA促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增加2.2 ATRA增强BMP9诱导C3H10T1/2细胞OPN表达BMP9组与ATRA组OPN蛋白表达水平较对照组明显增加，BMP9与ATRA合并使用组OPN表达水平明显高于BMP9组或ATRA组（D9变化更明显，图2）。提示ATRA能促进BMP9诱导C
19、3H10T1/2细胞OPN表达。 对照组 BMP9组 ATRA组 BMP9+ATRA组A：第9天；B：第11天图2参照近年本刊，补充片段大小值；没有定量分析？ ATRA促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞骨桥素蛋白表达2.3 ATRA增强BMP9在C3H10T1/2细胞中诱导钙盐沉积单用BMP9组钙盐沉积明显强于对照组，ATRA组钙盐沉积与对照组相比无明显区别；BMP9合并ATRA组钙盐沉积与BMP9组相比显著增强（图3）。提示ATRA能促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞钙盐沉积。 对照组 ATRA组 BMP9组 BMP9+ATRA组第14天第20天图3 ATRA促进BMP9诱导C3H1
20、0T1/2细胞钙盐沉积A：钙盐沉积染色；B：定量分析 *：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.05，与BMP9组比较2.4 ATRA增强BMP9在C3H10T1/2细胞中诱导BMPR-Smad报告质粒萤光素酶活性及促进Smad-1/5/8磷酸化 与对照组相比，BMP9明显增加BMPR-Smad报告质粒萤光素酶活性（P<0.01），ATRA也能增加BMPR-Smad报告质粒萤光素酶活性（P<0.05）；BMP9与ATRA合用后，BMPR-Smad报告质粒萤光素酶活性较BMP9组明显增加（P<0.01，图4A）；Smad-1/5/8磷酸化检测结果也呈现相同变化趋势
21、（图4B）。A横纵坐标标目改为中文；参照近年本刊补充统计学注释：报告质粒检测；B补充相对分子质量；没有定量分析？：Western blot分析 *：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.05，#：P<0.01，与BMP9组比较A横纵坐标标目改为中文；参照近年本刊补充统计学注释：报告质粒检测结果；B补充相对分子质量；没有定量分析？：Western blot分析图4 ATRA促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞BMP-Smad信号活化3 讨论本研究发现，全反式维甲酸（ATRA）能明显促进BMP9诱导间充质干细胞成骨分化。其机制至少与ATRA增强BMP9诱导BMP-Smad信号
22、转录活性有关。在组织骨工程中，间充质干细胞是比较理想的种子细胞，如何促进种子细胞成骨分化是目前亟待解决的关键问题之一1。ATRA是维生素A在体内代谢生成的一类化合物，介导维生素A对个体生长和发育的作用。研究表明ATRA能促进干细胞或前体细胞终末分化,并已成功将用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）的治疗5。ATRA对干细胞成骨分化的影响存在争异，有研究认为ATRA能抑制干细胞成骨分化6；另有研究显示ATRA能促进脂肪来源未分化的脂肪细胞以及间充质干细胞分化为成骨细胞7-8。骨形态蛋白(bone morphogenetic protein,
23、 BMP)属于转化生长因子超家族成员之一，对干细胞成骨分化具有重要调控作用13。He等2发现除传统的BMP2和BMP7外，BMP4、BMP6和BMP9也能促进间充质干细胞成骨分化，并且BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的能力明显强于其他BMP成员。因此，增强BMP9诱导干细胞成骨分化能力的因子具有重要意义。Ni等3发现经典的Wnt/-catenin信号在BMP9诱导成骨分化过程中具有重要作用，Liang等4研究表明胰岛素样生长因子-2（Insulin-like Growth Factor 2，IGF-2）能明显增强BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化。前期研究发现，ATRA能抑制骨肉瘤细胞增殖并增
24、强曲格列酮对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用，其机制与ATRA能诱导或协同曲格列酮诱导骨肉瘤细胞骨向分化有关9,14。ATRA对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响尚不清楚，因此本研究通过体外实验，明确ATRA对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的可能影响。结果表明，ATRA单独应用虽然不能诱导间充质干细胞成骨分化，但能明显增强BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的能力，即ATRA对BMP9诱导间充质干细胞ALP活性增加、OPN表达及钙盐沉积均具有明显促进作用。机制分析发现，ATRA能增强BMPs-Smad信号转导，与BMP9合用后这种作用进一步增强；通常认为BMP9通过经典的BMPs-Smad信号通路
25、实现对干细胞成骨分化调节15。提示ATRA增强BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用可能与促进BMPs-Smad信号转导有关。实验结果证实ATRA能促进干细胞成骨分化，与其他文献报道不一致。我们认为出现这种情况可能是与不同实验所用干细胞种类、干细胞所处的分化阶段以及合用的诱导干细胞成骨分化因子不同有关。本研究为有效促进种子细胞成骨分化提供了一种可能更为有效的方法，将有利于组织骨工程的发展。本研究仅从体外实验证实ATRA能促进BMP9诱导间充质干细胞成骨分化，尚缺乏体内实验证据。本课题组将进一步通过体内实验和组织培养实验，确证ATRA对BMP9诱导干细胞成骨分化的影响及其具体机制，为增强BMP9
26、诱导干细胞成骨分化能力，促进组织骨工程发展提供理论及实验基础。参考文献：文献注录格式不规范，请参照近年本刊格式完善1 Arthur A, Zannettino A, Gronthos S. The therapeutic applications of multipoten-tial mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repairJ. J Cell Physiol，2009; 218(2): 237- 245.2 Kang Q, Sun MH, Cheng H, et al. Characterization of the di
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