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1、人脂联素真核表达载体的构建及其表达周 静1 姜 政1 孙 伟2 陶小红1 黄爱龙3 王丕龙1（重庆医科大学:1附属第一医院消化内科, 3肝炎研究所, 重庆 400016；2第三军医大学西南医院感染病研究所，重庆400038）摘要：目的 构建人脂联素的真核表达载体，并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达，为脂联素在非酒精性脂肪肝病的基因治疗奠定基础。方法 从人脂肪组织中提取总RNA，通过RT-PCR方法获得人脂联素基因，将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上，构建重组质粒pEGFP-N1-ADPN，转染真核表达细胞COS-7中，并通过SDS-PAGE和Western blot检测融合
2、蛋白在真核细胞中的表达。结果 通过RT-PCR方法克隆人脂联素基因744bp，测序结果显示，1个碱基发生突变，654位：AT，突变率为0.1，氨基酸GluAsp。通过SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白分子质量约为55×103（绿色荧光蛋白分子质量约为27×103），说明脂联素基因在真核细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合。结论 成功的构建了真核表达载体，并在真核细胞中表达。脂联素是脂肪细胞特异性分泌的多种细胞因子之一，其生理作用机制尚未阐述清楚，但越来越多的证据显示体内脂联素水平的异常在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发展过程中起着重要的作用，可能参与了胰岛
3、素抵抗、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化的发生与发展，对NAFLD的有效防止可阻止慢性肝病进展并改善预后1。本研究从人脂肪组织中提取mRNA，通过RT-PCR获取脂联素基因, 将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1上，并转染到真核表达细胞COS-7中，通过RT-PCR、Werstern-blot以及绿色荧光检测融合蛋白的表达，为进一步研究其信号转导通路及在非酒精性脂肪性肝病中的作用奠定了基础。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 组织和载体 脂肪组织取自本院胃肠外科手术患者腹部皮下脂肪组织；大肠杆菌菌株JM109及真核表达载体pEGFP-N1由重庆医科大学附属第一医院向廷秀博士惠赠；细胞
4、株COS-7由重庆医科大学肝炎研究所郭辉老师惠赠。1.2主要试剂及工具酶 Trizol购自Tiangen公司，RT-PCR试剂盒，限制性内切酶Hind、Sal和T4 DNA Ligase购自TaKaRa公司，胶回收纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，质粒提取试剂盒购自Omega 公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司， SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和兔抗GFP抗体购自碧云天生物技术研究所。1.2方 法1.2.1引物设计合成 根据GenBank中人脂联素基因序列，设计其引物，上游引物：5'-CCAAGCTTATGCTGTTGCTGGGAGCT-3&#
5、39;，其前加入Hind 酶切位点及其保护性碱基CC，下游引物：5'-GCGTCGACTAGTGGTGATCAGTTGGTG -3'，其前加入Sal酶切位点及其保护性碱基GC，扩增长度为744bp。同时设计内参-actin引物，上游引物：5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，下游引物：5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3'，扩增长度为272bp，引物由上海生工合成。1.2.2脂肪组织总RNA的提取 取约50mg脂肪组织放入液氮预冷的碾钵中，边加液氮边碾磨，直到碾成粉末，将其转移到预先加有1ml Trizol的
6、EP管中，按Trizol说明书操作获取脂肪组织的总RNA。取少部分RNA测其纯度和浓度并电泳。1.2.3 RT-PCR扩增目的基因 严格按照说明书进行操作，所获PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳，同时进行凝胶回收。1.2.4 重组载体的构建 分别将目的基因和质粒pEGFP-N1进行Hind和Sal双酶切，并经PCR纯化试剂盒纯化；将纯化的目的基因和pEGFP-N1按4:1（物质的量）比例，在4条件下连接过夜并转化感受态细菌JM109，通过卡那霉素（25g/mL）抗性筛选重组载体，重组质粒命名为pEGFP-N1-ADNP。1.2.5重组载体的鉴定 1.2.5.1 酶切鉴定 取1.5ml过夜菌液提取重
7、组质粒，与空质粒pEGFP-N1一起分别进行单酶切（Hind）、双酶切（Hind和Sal）。而后进行1琼脂糖凝胶电泳，重组质粒经过双酶切是否能够切出目的基因条带。1.2.5.2测序鉴定为了进一步从序列的准确性上得到验证，将SalI和Hind酶切后电泳出现约744bp的阳性克隆菌株送到上海生物工程有限公司测序，使用T7通用引物，并将测序结果与GenBank中发表的脂联素cDNA序列进行比对。1.2.6重组质粒在真核细胞中的表达1.2.6.1以绿色荧光检测目的蛋白的表达 将重组质粒pEGFP-N1-ADNP以脂质体介导的方法转染COS-7细胞，并以pEGFP-N1和灭菌ddH2O为对照，每组转染两
8、孔。24h后在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。同时收集转染48h后的细胞分别提取总RNA，行RT-PCR反应，所获PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳。1.2.6.2 以Werstern blot检测目的蛋白的表达 将上述3组转染细胞分别用PBS洗涤3次后，加入裂解液400l和PMSF 4l提取蛋白。分别取50l蛋白溶液加入5×SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴5min，离心取上清液上样进行聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE），然后电转将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，以兔抗GFP抗体及鼠抗actin为一抗，以抗兔IgG和抗鼠IgG为二抗，DAB显色，至显色清晰后，立即置于蒸馏水中终止显色，扫
9、描保存。2 结果2.1 RT-PCR扩增目的基因、目的基因 提取脂肪总RNA，经过琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5S 3个条带，分光光度计结果：D（260）D（280）为1.88，D（260）D（230）为1.57，浓度约为1g/l，符合实验的需求。同时进行RT-PCR扩增并1琼脂糖凝胶上电泳，在744bp附近有特异性扩增条带，此条带电泳位置与实验设计相一致，提示扩增产物为脂联素片段。2.2 重组质粒pEGFP-N1-ADPN鉴定 2.2.1 酶切鉴定 将重组质粒，与空质粒一起分别进行单酶切（Hind）、双酶切（Hind和Sal），同时进行1%琼脂糖凝胶电泳，重组质粒双酶切可见两个条带，大
10、片段与载体pEGFP-N1大小（4700）一致，而小片段与目的基因大小（744）一致，而空质粒中无目的基因，上述结果证明重组质粒构建成功（图1）。引用图题请按照阿拉伯数字的顺序先后引用，不能先引图4再引3！图1: 重组质粒酶切鉴定M1: DNA 标准(-EcoT14 I digest )1: pEGFP-N1空质粒;2: pEGFP-N1-ADPN重组质粒;3: HindIII酶切空质粒4: HindIII酶切重组质粒;5: HindIII和Sal I酶切空质粒;6: HindIII和Sal I酶切重组质粒7: 脂联素RT-PCR产物;M2 :DNA 标准(DL2000)2.2.2测序鉴定 通
11、过测序分析，发现目的基因片段有1个碱基突变，是654位：AT，突变率为0.1，氨基酸GluAsp，因同为酸性氨基酸，不影响其编码及功能。 2.3重组质粒在真核细胞中的表达 2.3.1以绿色荧光检测重组质粒在真核细胞中的表达 转染24h后在荧光显微镜下观察，pEGFP-N1转染组和重组质粒转染组可见到绿色荧光，灭菌ddH2O转染的细胞未见到荧光。2.3.2 以Werstern blot检测目的蛋白的表达 在线软件预测该绿色荧光蛋白相对分子质量约为27×103，融合蛋白分子质量约为55×103，Werstern blot经 DAB显色如图，重组质粒转染组在55×103
12、左右见一特异性条带，在27×103位置没有条带，空质粒转染组在27×103见一特异性条带，在55×103位置没有条带，灭菌ddH2O在27×103和55×103均未见条带，三者在43×103位置均见内参条带（图2）。说明脂联素cDNA在真核细胞中表达蛋白并与绿色荧光蛋白融合。图2: Western blot方法检测重组质粒在COS-7细胞中表达 1: ddH2O转染在COS-7细胞中的表达2:空质粒在COS-7细胞中的表达 3:重组质粒在COS-7细胞中的表达 3 讨 论脂联素是由一种由APM1基因编码的脂肪细胞分泌特异性的血浆蛋白3
13、。近年来发现脂肪组织不仅贮藏能量，还能分泌多种影响胰岛素敏感性的细胞因子，据研究脂联素是目前已知的唯一1个与肥胖呈负性相关的脂肪分泌蛋白4 5 。多项研究表明6-8，血清脂联素与NAFLD的发生存在着密切的关系，其作为一个保护性因子可预防或延缓NAFLD的发生与发展。Aygun等9 对29例证实伴有肝功能异常的NAFLD患者、20例临床诊断不伴有肝功能异常的NAFLD患者以及20例对照者进行研究。通过对脂联素、血脂和体重指数检测，结果表明血清脂联素具有抗炎、抗糖尿病以及抗肥胖的作用；同时具有保护肝脏的作用，随着脂联素水平的下降，肝脏的炎症、坏死随之加重。因此将脂联素cDNA导入表达载体中进行表
14、达，补充机体脂联素的不足，是目前预防和治疗NAFLD的一个发展方向。为了进一步研究脂联素在NAFLD的作用机理及基因治疗途径，本课题构建脂联素重组载体并在真核细胞中表达，结果显示：成功地构建了人脂联素重组载体，通过测序分析目的基因有1个碱基突变，654位：AT，突变率为0.1%，氨基酸GluAsp。通过SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白相对分子质量约为55 ×103（绿色荧光蛋白相对分子质量约为27×103），而且能够被抗荧光蛋白抗体识别，说明脂联素cDNA能够在真核细胞中表达，这为下一步治疗NALFD奠定了基础。参考文献1 Berner HS, Lyn
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