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1、EGFR基因对晚期非小细胞肺癌治疗方案选择影响的研究肺癌是当今世界上发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。世界卫生组织（ WHO） 2014 年 11 月公布的资料表明， 2012 年全球肺癌新发病例 180 万人次，死亡人数 159 万人次，在所有恶性肿瘤中其发病率（ 16.7%）和病死率（ 19.4%）均居首位 1 。肺癌早期缺乏特异性临床表现， 约 70%患者确诊时已属晚期，失去手术治疗机会，仅适合以化疗为主的治疗。最新 NCCN指南中指出，初诊的非小细胞肺癌（ NSCLC）患者应行 EGFR基因检测，对于 EGFR基因敏感型突变的患者，一线治疗首选人表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂（ EGFR-TK
2、Is）靶向治疗，对于 EGFR基因野生型及耐药型突变的患者首选化疗。但大部分患者接受一线治疗后，疾病会在一个较短的缓解期后发生复发或转移，对于二、三线治疗方案的选择，指南中推荐化疗或靶向治疗，但方案选择的具体依据并未给出。一些早期的研究表明 2 ，EGFR-TKIs 与安慰剂对比， 可明显延长患者生存期并减轻患者临床症状。 TITAN 及 IPASS3-4 实验表明，晚期 NSCLC患者二线使用 EGFR-TKIs 与标准化疗相对比，患者总生存期（ OS）与无进展生存期（ PFS）并无显著差异，但在药物毒副反应方面存在明显优势。因此有学者认为 5 ，对于 EGFR敏感突变的患者，EGFR-TK
3、Is 在一线或二、三线治疗均能获益，故EGFR-TKIs 的使用时机仍有待研究。但有研究表明，对于EGFR基因敏感突变的患者，EGFR-TKIs 作为一线方案或二线方案治疗的临床缓解率不尽相同，但其机制尚不明确1 ， 6-8 。在临床中，我们观察到部分 EGFR基因野生型患者在化疗后使用EGFR-TKIs 有显著疗效。因此我们推测患者肿瘤基因的EGFR表型并不稳定，是随着疾病的进展及治疗发生着改变，EGFR基因的监测对NSCLC的治疗可能具有指导意义。目前临床主要使用组织穿刺活检进行EGFR基因检测，该方法对患者创伤大，临床难以实现重复取材，无法动态监测患者EGFR基因。随着分子生物学发展，大
4、样本的研究9-10提示，肿瘤患者外周血游离 DNA含量明显上升， 且大部分为肿瘤组织所释放， 其 EGFR 基因检测与组织相比一致性好， 约为 79.7% 94%。该方法为实现动态监测患者 EGFR基因状态提供了可能。本研究通过监测 NSCLC患者化疗前后外周血游离DNA EGFR基因状态，为临床治疗方案的制定提供理论依据。1 资料与方法1.1 一般资料收集2014年8 月1 日 2015年6 月1 日就诊于石河子大学第一附属医院的晚期肺腺癌患者，共计40例。入组标准：入组患者均经组织学或细胞学确诊为非小细胞肺腺癌，且已行组织病理学EGFR基因检测（ ARMs法）；临床分期 B期；年龄 20岁
5、； ECOG功能状态评分 0 2 分，具有可测量病灶；重要脏器功能基本正常；患者自愿接受以顺铂为基础的化疗方案，并能够依从研究和随访研究。所有入组患者均已签署知情同意书，本研究已通过石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会审核。1.2 方法入组患者给予以铂类为基础的化疗，所有患者治疗前一天水化处理减轻化疗反应，化疗当日给予止吐处理。每 2 周期复查肺部 CT，依据 RECIST 1.1 实体瘤疗效评价标准评估疗效，分为完全缓解（ CR）、部分缓解（ PR）、疾病稳定（ SD）、疾病进展（ PD）。1.3 主要仪器与试剂研究所用仪器（包括低温离心机、NanoDrop DNA浓度测试仪、 PCR仪、
6、凝胶图像成像仪等）主要由新疆石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室提供。使用德国Qiagen 公司的QIAampBloodMinKit试剂盒进行样本DNA提取。1.4 样本采集采集患者静脉血5 ml ， 2 h 内提取血清，3000 r/min，离心 10 min （ r=18 cm ），取上层血清 - 80保存。1.5 DNA提取及质控 按 QIAampBloodMinKit 试剂盒说明书提取样本 DNA，利用 NanoDrop检测样本 DNA的浓度和纯度， A260/A280 值为 1.6 2.2 ，DNA浓度 2.4 27.6 ng/ l ，- 80 保存。1.6 PCR扩
7、增及基因测序根据 GenBank数据库检索得到人 EGFR基因序列，设计EGFR外显子 19 和 21 的引物，经NCBIBLAST同源性检索后，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列见表1。PCR体系含 DNA模板 4 L，PCRmix 25L，上游引物 2 L，下游引物 2 L，无酶水 17L，总体积 50 L。 PCR循环： 95预变性 5 min ；进入循环扩增阶段， 95 摄氏度变性30 s，55退火30 s，72延伸 45s，此阶段共 35 个循环；最后 72保温 15 min 。基因测序：取5 L PCR 产物与 1L Loading Buffer混匀，经2%琼脂糖凝胶 92
8、V 电泳 40 min 后，用紫外光透视仪分析图像并照相。最终 PCR产物送北京华大基因完成测序，使用CHROMAS软件进行阅读。1.7 EGFR 基因外显子 19 和 21 片段突变结果判读 EGFR基因 19 外显子突变为缺失突变， 测序结果行 NCBIBLAST与野生序列进行对比，若测得序列与野生型序列吻合且无套叠样峰图，判读为野生型，见图 1；若表现为一段序列缺失或为野生型与突变型套叠样峰图，判读为突变型，见图 2、图 3。 EGFR 基因 21 外显子突变为 L858R 突变，若所测得结果与野生型序列吻合且无套叠样峰图，判读为野生型，见图 4；若为单一 T/G 突变或表现为 T/G
9、套叠样峰图，判读为突变型，见图 5。EGFR 19外显子及 21 外显子突变均为 EGFR-TKIs 敏感突变，见表 1。1.8 统计学分析 使用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析，使用 Kappa 评分分析组织与血清 EGFR突变一致性， 使用 2检验分析患者化疗前后 EGFR基因突变的差异及 EGFR基因突变与临床疗效的关系，检验水准 =0.05 。2 结果2.1 患者临床特征 入组 40 例患者中 38 例患者试验成功，失访 1 例，DNA提取失败 1 例。38 例患者中男性患者 25 例，女性患者 13 例；年龄 47 74 岁，中位年龄 60 岁。有吸烟史者 20 例，不吸烟者
10、 18 例（不吸烟为不吸烟或每年吸烟0.75 ），可得结论：血清与组织两种样本EGFR基因检验一致性较好。2.4 患者化疗前后血清 EGFR基因突变状态比较 患者化疗后血清 EGFR基因突变发生率为 50%（19/38 ），其中 19 外显子突变 13.2%（ 5/38 ），21 外显子突变 36.8%（ 14/38 ），仍以 21 外显子突变为主 73.7%（ 14/19 ）。其中化疗前后均为阳性患者 12 例，化疗前后均为阴性患者 14 例，突变一致率为68.4%（26/38 ）；5 例患者由阳性转为阴性， 7 例患者由阴性转为阳性，但化疗前后 EGFR基因突变总体差异无统计学意义（ 2=
11、3.60 ，P=0.165 ）。2.5 患者 EGFR基因突变状态与化疗疗效的关系者均接受以铂类为基础的化疗，其中 CR0 例，PR 638 例患例（ 15.8%），SD 21 例（ 55.3%）， PD 11 例（ 28.9%），疾病控制率 71.1% （ 27/38 ）。其中 EGFR突变阳性患者（以组织学为准）疾病控制率为88.2%（ 15/17 ），EGFR阴性患者疾病控制率为57.1%（ 12/21 ），差异显著（2 值无， P=0.01 ）。化疗疗效与患者EGFR基因变化情况行单因素logistic回归分析，回归系数为 0.465 ， P=0.227 ，OR=1.592（0.748
12、-3.387）。可得结论：以铂类为基础的一线化疗对EGFR基因突变阳性患者的疗效优于 EGFR基因突变阴性的患者。化疗疗效与化疗前后EGFR基因状态改变与否无关。3 讨论本研究前瞻性的监测了接受化疗的晚期NSCLC患者 EGFR基因状态的改变，且使用血清提取外周血游离DNA，有效的排除了血液标本中有核细胞对试验结果的影响。研究观察到部分患者的EGFR基因状态在治疗的过程中发生了改变。由于设置安慰剂组对照有悖于伦理，尚不能确定产生该现象产生的原因是由于化疗或是疾病的自然进程。但有研究表明11 ，对 EGFR 19外显子突变的 NSCLC细胞系进行铂类耐药处理的同时，该细胞对 EGFR-TKIs
13、的敏感性降低。亦有研究表明 12 ，部分患者原发灶与转移灶的EGFR基因状态并不一致。因此，我们可以推测，造成患者EGFR基因检测结果变化的原因是多元化的。NCCN指南指出一线治疗时应先行EGFR基因检测，对于初诊 EGFR基因敏感突变的患者首选EGFR-TKIs。本试验结果亦表明 EGFR-TKIs 应作为一线治疗。虽然研究结果显示对于EGFR基因敏感突变的患者，EGFR-TKIs 与化疗效果均优于EGFR基因野生型患者， 但化疗毒副反应重， 对患者损伤较重，且部分患者会因发生EGFR基因表型的改变，导致该患者错失使用 EGFR-TKIs 的机会。对于初诊EGFR基因野生型的患者，也并非彻底
14、丧失了EGFR-TKIs 的使用机会。研究结果显示，仍有小部分患者在经历了化疗之后EGFR基因由野生型向敏感型转变，并且该转变与化疗的疗效并没有明显联系。由此可见，一、二线化疗失败后再次进行EGFR基因检测是有必要的，对于再次检测发现突变的患者，二、三线治疗选择 EGFR-TKIs 不失为一个明智的选择。本研究显示，晚期NSCLC患者在疾病的发生、发展及治疗的过程中，其EGFR基因状态随时可能发生改变，但本试验仍存在可改进之处。首先，本研究样本量小不可避免的会产生误差，尚需要多中心、大样本量的研究来验证我们的试验结论。另外，本研究因临床二次组织取材困难，未能获得患者化疗后肿瘤组织，目前由于技术限制，血液学标本EGFR基因检测较组织标本假阴性率高，有待有条件的中心进步一证实本研究结论，获得更加强有力的证据，为晚期NSCLC患者的治疗提供新的思路。