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1、凝胶迁移实验( EMSA )凝胶迁移或电泳迁移率实验 ( EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA吉合蛋白和其相关的DNA吉合序列相互作用 的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA吉合蛋 白，目前已用于研究RNA吉合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。实验步骤：探针的标记-探针的纯化-EMSA胶的配制-EMSA结合反应 f电泳分析 一、探针的标记1. 设置探针标记的反应体系；2. 使用水浴或PCF仪，37C反应10分钟；3. 加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。4. 再加入89微升TE,混匀。此时可以取
2、少量探针用于检测标记的效 率。通常标记的效率在 30%以上，即总放射性的 30%以上标 记到了探 针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。5. 标记好的探针最好立即使用， 最长使用时间一般不宜超过 3天。标 记好的探针可以保存在-20 C。探针的纯化1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入 2 体积即 200 微升的无水乙醇，混匀。2. 在-70 C至-80 C沉淀1小时，或在-20 C沉淀过夜。3. 在4C, 12 000 g-16 000 g 离心30分钟。小心去除上清，切不可 触及沉。4. 在4C, 12 000 g-16 000 g 离
3、心1分钟。小心吸去残余液体。微 晾干沉淀，但不宜过分干燥。5. 加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用， 最长使用时间一般不宜超过 3天。标记好的探针可以保存在-20 C。三、EMSA胶的配制1. 准备好倒胶的模具。 可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具， 或其 它适当的模具。 最好选择可以灌制较薄胶的模具， 以便于干胶等后续 操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA胶的模具。2. 按照如下配方配制 20 毫升 4的聚丙烯酰胺凝胶 （ 注意：使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis 对结果影响不大 ） 。3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEME前先混匀，加
4、入TEME后 立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳 齿。如果发现非常容易形成气泡， 可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷 化处理。四、EMSA吉合反应1. 如下设置EMSA吉合反应阴性对照反应：（1 ）Nuclease-Free Water ： 7 微升。（2）EMSA/Gel-Shift 吉合缓冲液 （5X） ：2 微升 （ 3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0 微升。（4）标记好的探针 ： 1 微升。（ 5）总体积 ：10 微升。样品反应：（1 ）Nuclease-Free Water ： 5 微升。（2）EMSA/Gel-Shift 吉合缓冲液 （5X） ：2 微升 （
5、 3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2 微升。（4）标记好的探针： 1 微升。（ 5）总体积： 10 微升。探针冷竞争反应：（1 ）Nuclease-Free Water ： 4 微升。：2 微升（2）EMSA/Gel-Shift 吉合缓冲液 （5X）3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2 微升 （ 4）未标记的探针： 1 微升。（5）标记好的探针： 1 微升。（ 6）总体积 ：10 微升。 突变探针的冷竞争反应：（1）Nuclease-Free Water ： 4 微升。（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液 （5X） ：2 微升（ 3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2 微升。（ 4）
6、未标记的突变探针： 1 微升。 （5）标记好的探针： 1 微升。（6）体积 ：10 微升Super-shift 反应： （1）Nuclease-Free Water ：4 微升。（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液 （5X） ：2 微升（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2 微升。（4）目的蛋白特异抗体 ：1 微升。（5）标记好的探针： 1 微升。6）总体积 ：10 微升2. 按照上述顺序依次加入各种试剂， 在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20-25 C ）放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的 非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混 匀，室温（20
7、-25 C ）放置20分钟。3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（无色，10X），混匀后立 即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和 DNA的结合，建 议尽 量使用无色的 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液。如果对于使用无色上样 缓冲液在上样时感觉到无法上样， 可以在无色上样缓冲液里面添加极 少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。五、电泳分析1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预 电泳的时候如果有空余的上样孔， 可以加入少量稀释好的 1X 的 EMSA 上样缓冲液 （蓝色） ，以观察电压是否正常进行。2. 把混合了上样缓冲液的
8、样品加入到上样孔内。 在多余的某个上样孔 内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色）， 用于观察电泳进行的情况。3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过 30C，如果温度 升高，需要适当降低电压。 电泳至 EMSA/Gel-Shift 上样缓 冲液中的 蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘 1/4 处，停止电泳。4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电 压液。小心打开两块胶板中的上面一块 （ 注：通常选择先移走硅烷化 的那块玻璃板），把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个
9、 EMSA胶， 轻轻把滤纸和胶压紧。 滤纸被胶微微浸湿后 （大约不足 1 分钟），轻轻 揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平， 在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当 仪器设备检测。EMS/实验成功的关键因素：1. 试验设计用药品刺激细胞时 ,设计的药品浓度和时间梯度的问题 , 这个很关键！ 总结建议: 一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多 时候都是在 45min 和 1h 达到高峰，当然还有合适
10、的浓度！二是用药 物刺激产生受体可能时间会长一些， 因为药物还有一个渗透和刺激产 生细胞因子的过程。时间可以长一些 , 主要根据自己的药物刺激特性 确定时间点。2. 核蛋白样品的制备（1）注意用专用的核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像；（2）掌握好核蛋白的浓度和纯度，尤其是浓度。能入核的蛋白本来 就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是比较高的 ! 一般要求在 1ug/ul 以上！有时候稍 微低于这个数量级也可以， 但是不能太低， 否则影响结合反应拿不到 结果。这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失。（ 3）同时，一般制备
11、核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好 做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多。 而组 织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会不容易得到EMSAB性结果！3. 探针的制备 :生物素标记到 3'端还是 5'端？其实我觉得最好还是两端都标记 , 这样才能更好的提高灵敏度 , 国内的标记技术我还不是很了解 , 我们 这边的探真都是国外定做的 , 还算可以 , 其制作程序如下 : 合成寡核 苷酸- 标记生物素 - 纯化- 退火合成双链 . 也是一个比较复杂的 过程。（在EMSA操作中会用到同位素，要注意实验室环境和实验 员的保护）4. EMSA实验技术要点（1）制胶 必须
12、是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变 性胶. 制胶很重要 , 直接影响电泳的效果 ! 一般控制在 5 分钟凝固的效 果.10X TBE 1.0ml 40% Acrylamide （ 40%聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol （50%甘油） 1.0mldH20 （蒸馏水）14.8mlTEME（四甲基乙二氨）20 口1脱气 10min10% AP （过硫酸氨）1201总量 20.0ml（2） 探针用量：这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最 少 50fmol.（3）蛋白样品用量：一般用量在2-20ug（控制在1-5卩l）蛋白 总 体系 15ul. 细
13、胞核抽屉物浓度都比较低 , 组织的一般都比较高 , 因为 杂蛋白较多 .其他的对照的含义 ：.常规反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针）；阴性对照反应（核蛋白+标记探针）; 阳性对照 （核蛋白+标记探针 ） 探针冷竞争反应 （含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+ 标记探针 100 倍量的未标记探针 ）； 突变探针的冷竞争反应 （含激活的目的转录因子的 核蛋白+标记 探针+标记探针 100 倍量的未标记突变探针 ）； Super-shift 反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+ 目的转录因子的特异抗体 ).(4) 预电泳和电泳：0.25X TBE在冰上120V预电泳1小时；
14、务必换 掉预电泳的缓冲液，用新的0.25X TB低温下150V,电泳约60分钟。 注意横压电泳的时候注意电流的数字变化 , 记录开始电泳和电泳结束 的电流数据的变化 !( 5)电转运在0.5X TBE中390mA电转移40分钟，注意转运膜的选择,有一种离 子加强型的转运效果比较好 ! 我当初选择过一般的和离子加强型的 , 还是离子加强型结合效果好 !( 6)紫外交联 : 正规的应该是紫外交联仪的使用 , 但是很多单位没有 交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以 了! 这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的 !( 7)化学发光反应包括 Blocking Buffer 3
15、0 分 钟封 闭 , Streptavidin-HRP 标 记 , Washing Buffer 洗涤； Equilibration Solution平衡 , 这些按照规定操作即可 ! 没有太多的细节 , 只是注意两点 , 一是期间结合膜的表 面一定不能干燥 ! 二是 Streptavidin-HRP 不能加在膜上 , 而是加在液 体中混韵后在将膜放在液体中孵浴 .( 8)化学发光图像显示两种方法 : 化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和 Western 试验操作相当 , 只是这个膜是一次性的 , 不能重 复使用 , 一定保存好图片 !由于跑得是非变性凝胶 , 蛋白保持天然构 想和活性，所以代条很可能是一块一块的而不像 WB那样很规整的一 条细线, 这个很正常 !（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收 获，努力就一定可以获得应有的回报）