《光合细菌和芽孢杆菌的混菌培养,.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《光合细菌和芽孢杆菌的混菌培养,.docx（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、曹希亮倪学勤曾东周小秋摘 要 利用光合细菌和蜡样芽抱杆菌协同生长的特点进行混菌培养试验。蜡样芽抱杆菌好氧，光合细菌兼性厌氧，通过两种细菌的不同添加比例，寻找一种最好 的添加比例，使光合细菌活菌数在最短的时间内达到最大值。试验过程中，采用正交试验对两种菌的比例进行了科学的组合，从而找到两种菌的最佳配比：在光合细菌1源5%芽抱杆菌1%勺添加量的情况下，可以在最短的时间内使光合细 菌菌数达到理想值。关键词 光合细菌；混菌培养；正交法中图分类号Q93-33近年来，随着生活水平的提高，人们对畜禽产品质量的要求越来越高，绿色食品越来越受到消费者的宵睐。因光合细菌营养丰富，提高畜禽免疫力方面效果显著， 而且
2、在水产养殖方面，能净化水质，提供一部分活性氧，所以很多研究者对其尤 为重视1-3。但因为光合细菌培养周期长，菌数很难达到人们要求，所以，研 究者采用各种方法进行了光合细菌混菌培养试验的研究。Giraud E Z 和Fleischman D (2004)研究发现，当光合细菌与根瘤菌共同培养时，可增强根瘤菌 抗十扰能力，储藏的时间更长，在豆科植物上能形成更有效的根瘤，从而增加植物 的产量4。李勤生等(1998)采用光合细菌不同菌株、光合细菌菌株与异养菌 株混合培养，试验结果发现，不同组合的混合培养物其生长量均不同程度的高于 单株培养物，最高增长量高达17.4%，最低也高于对照组5。本试验是在光合细
3、菌单菌培养的基础上，进行了光合细菌和芽抱杆菌的混菌培 养，目的就是提高光合细菌的生长速度，缩短培养周期，增加光合细菌的活菌数。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种光合细菌(9.0 X 108 CFU/mD和蜡样芽抱杆菌(1.0 X 109 CFU/mD均由本实验 室分离、筛选、鉴定、保存。1.1.2培养基1.1.2.1 光合细菌富集培养基乙酸钠 3.0 g、丙酸钠 0.3 g、NaCl 1.0 g、(NH4)2SO4 0.3 g、MgSO4 0.2 g、 KH2PO4 0.5 g、K2HSO4 0.3 g、CaCl2 50 mg、MnSO4 2.5 mg FeSO4 5 mg 酵 母膏0
4、.l g、蛋白月东10 mg、谷氨酸0.2 mg、H2O 1 000 ml ,将以上组分溶于水 后调pH值为7.4，然后在121.0 C蒸汽灭菌30 min。1.1.2.2 芽抱杆菌肉汤培养牛肉膏 5.0 g、蛋白月东 10.0 g、NaCl 5.0 g、H2O 1 000 ml , pH值 7.4 7.6 , 121.0 C下蒸汽灭菌30 min。1.1.2.3 芽抱杆菌平板普通培养基在肉汤培养基的基础之上，加入琼脂 1.0%, 121.0 C下蒸汽灭菌30 min。1.1.2.4 光合细菌计数培养基NaHCO3 1.0 g CH3COONa 3.0 g 酵母膏 2.0 g、K2HPO4 0
5、.5 g> Fe-EDTA 0.005 g、NH4Cl 1.0 g、MgCl2 6H2O 0.2 g、NaCl 5.0 g、H2O 1 000 ml, pH值 7.4 7.6、121.0 C 下蒸汽灭菌 30 min。1.1.3仪器微量加样器、平板、1 ml移液管、漩涡振荡器、试管等。1.2培养方式和条件1.2.1蜡样芽抱杆菌摇床培养用接种环刮取斜面保存的蜡样芽抱杆菌， 平板划线，进行活化，37 C培养24 h0 使用灭菌的250 ml三角瓶装芽抱杆菌肉汤培养基 3040 ml ,从平板上刮取菌 落，接种到肉汤培养基上，37 C、130 r/min摇床培养24 h。1.2.2光合细菌富集
6、培养6使用光合细菌富集培养基，在温度28 C ,光照60 W光源距离培养物1020 cm, 光照强度大约在6001 900 LX之间。选择1 000 ml的三角瓶，装入1 000 ml 光合细菌富集培养基，按不同比例接菌，使用封口膜封口，然后光照培养68 d, 观察颜色变化。颜色黑红色时保存，供混菌培养使用。1.2.3光合细菌和蜡样芽抱杆菌混合培养光合细菌富集培养基分装丁消蠹后的 200 ml三角瓶中，接种时采用光合细菌与 蜡样芽抱杆菌同时接种，其中光合细菌1%、5%、10%、20% 4个水平，而蜡样芽抱杆菌采用0.1%、0.5%、1% 2% 4个水平，用正交组合法接种，然后按光 合细菌富集培
7、养条件进行光照培养。每隔 24 h采样一次，进行光合细菌计数培 养，连续采样8d,每天计数培养一次。1.2.4细菌计数培养1.2.4.1 菌液稀释采用常规方法对菌液稀释，即用移液管0.5 ml菌液移丁盛有4.5 ml无菌水的试 管中，漩涡振荡5次，每次10 s ,以此类推，将菌液稀释至10-6、10-7、10-8。1.2.4.2 光合细菌计数培养用1 ml移液管取不同稀释度（一般为10-6、10-7、10-8）和不同接种比例的混合 培养后的菌液1 ml,加到灭菌的平板上，然后加 20 ml灭菌的（45土 1） C光 合细菌计数培养基，琼脂含量0.8%,摇匀；培养基冷凝后上层加5 ml灭菌的（4
8、5 土 1） C 1.0%的琼脂，冷却后置 2530 C, 2 0003 000 LX下培养48 h,如 果菌落不明显，则继续培养 2448 h o1.2.4.3蜡样芽抱杆菌计数培养用微量加样器取不同稀释度（一般为 10-1、10-2、10-3、10-4 ）的混合培养菌 液20 l ,同一稀释度在芽抱杆菌平板普通培养基上重复点样 3次，37 C培养， 12 h后观察计数。1.3分析方法1.3.1光合细菌的计数方法7-9一般采用双层培养基，上层是1%勺琼脂，底层是0.8%的琼脂。这种方法既解决 了试管计数过程中出现的重复多次计数的问题，使计数在同一平面进行，计数更准确，而且上层1%勺琼脂和底层0
9、.8%的琼脂在不影响光合细菌生长的情况下， 不但解决了光照问题，还解决了琼脂渗水的问题。1.3.2正交试验设计10表1为正交试验设计方案。正交法进行组合 L16（24）。表】止虞试验因会寿水半设叶（见）泉目T3456759IDni1213"14K瘀细菊115555 T0101010202020焙梯葬起杆菌Q.l Q.5120.10512 010.512Q.l0.5122结果（见表2）2.1光合细菌计数培养基中的形态观察光合细菌的典型特征是菌落呈粉红色、红色、红褐色或深红色，在计数培养基中菌落呈铁饼状表2 I(N)止吏试验果光台绷菌蜡梯莽皑杆曲M必45MMM7M麟Mara楼神比例陶崖抻
10、比例附|1Q CFU/ml no CFLVml no CFUM 1 0 CFU/ml flOCFU/ml) 10CFU/ml 1 0 CFUZml)10.105+582.57352I77.57774,75311130114122412150117113555o.ig90S5E75S5O.SO97.578B7.75751E2.587E4.253521127978.259100.10希4241 510100.504)43421110157435021Q25+55152.75)3200.105253744.75142D0 50474747T5101施57515Tfi702505854K1400.5S
11、7408300 25251 J心1S6Z53J0.25K419LZ531S5R214,33106.1 7也M皿表示在第n天光舍潮磁数/到最大值Ng表吊壅彻养过程中，同T虹理逃耽的两个萌数最多时的平境值第1利策4日光含匍菌荫敬未有最大值.2.2光合细菌正交试验从表2极差分析可以看出，光合细菌K1和K2的值都明显大丁 K3和K4的值，即 光合细菌在1僧日5%勺两个水平上，细菌计数明显高丁其它两组；而芽抱杆菌的 K3和K4明显大丁 K1和K2,即芽抱杆菌1斯日2%勺接种量，效果比其它两组更好。 而光合细菌和芽抱杆菌的极差分析表明，光合细菌的R=214.33,明显高丁芽抱杆菌的R=106.17,从而得
12、出如下结论，光合细菌的接种量对光合细菌的总菌数 的影响高丁芽抱杆菌的接种量对光合细菌总菌数的影响。2.3蜡样芽抱杆菌菌数变化时间胆图靖忏萍抱利前橹养的动感方差分折研寿图1通过SPSS13.0对蜡样芽抱杆菌的菌数变化进行了方差分析。我们发现，蜡 样芽抱杆菌菌数第1 d接种后，第2 d达到最大值，第3 d迅速下降，以后几天， 蜡样芽抱杆菌的数量没有明显的变化，这可能是因为蜡样芽抱杆菌开始形成芽 抱，进入了休眠状态。3讨论表2的结果说明光合细菌的添加比例 1咧日5%勺时候，光合细菌菌数高丁 10咧日 20%勺接种量。而10%： 20%勺接种量，最大值出现在第2 d或第3 d(Max2或Max3)。虽
13、然10咧日20%勺接种量生长速度增快，但是，由于菌数太低，效果不好。综合 考虑，从表2中发现，芽抱杆菌1%勺生长效果好一些。添加了芽抱杆菌由于该 培养基营养含量太低，芽抱杆菌很快就处于休眠状态如图1。所以对光合细菌的生长来说因为芽抱杆菌消耗一部分氧气，给光合细菌创造了一个有利于生存的厌 氧环境，所以有利于光合细菌的生长。在该试验中，光合细菌的添加比例 1呀日5%勺时候，光合细菌总数可以达到 109 CFU/ml左右，明显高于10咧日20啊个水平。并且光合细菌的添加对光合细菌总 数的增加的影响，明显高于芽抱杆菌的影响。从试验结果可以看出，不管是生长速度还是菌数，都没有达到一个理想的值，即 菌数达
14、到最大值的情况下，培养速度也提高了，降低培养时间的情形并没有出现。 究其原因，可能是因为所使用的分离培养基里所含的酵母膏太少，乂加入了芽抱 杆菌，所以营养成分消耗殆尽。说明光合细菌虽然利用很少的营养成分， 但是仍 然需要一定的营养。再有一种可能就是，刚开始，芽抱杆菌没有充分给光合细菌 创造一个完全的厌氧环境，所以，当光合细菌的加入量比较大时， 很快就进入了 衰退期，而光合细菌加入量较少的情况下，芽抱杆菌充分给光合细菌创造了厌氧 环境，光合细菌的菌数达到了最大。但是，因为加入的营养成分太少，所以光合 细菌生长的速度比较慢。为了达到一个最佳的效果，应该优化培养基，加入一定 量的酵母膏等营养成分，为芽抱杆菌创造一个增殖的环境，同时为光合细菌创造 一个更好的厌氧环境，使光合细菌生长速度更快。加入一定的营养成分对光合细 菌生长很重要，大多数营养都被芽抱所利用,但剩余少量的营养成分可以促进光 合细菌的生长，可以在更短的时间内达到更大的产量。所以，在光合细菌的光照、 温度等条件达到最佳的情况下，培养基优化对混菌培养来说是最重要的。培养基的优化，因为是光合细菌和芽抱杆菌混菌培养， 可以根据芽抱杆菌的营养 成分设计不同的水平，进行正交试验设计，选择最佳培养基，这方面的内容有待 于进一步研究。4